海洋稀有放線菌 Salinispora arenicola CNP193 基因組新穎PKS 和NRPS基因簇的發掘

房耀維, 劉 姝, 王淑軍, 呂明生, 焦豫良, 陳國強, 潘建梅, 牛 軍

(淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港 222005)

天然產物是開發新藥或重要先導化合物的主要源泉之一[1-2]。聚酮 (Polyketide) 化合物是功能和結構最多樣化的天然產物之一, 具有包括抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗病原生物、抗結核和免疫抑制等生物活性[3]。迄今, 通過活性追蹤指導從微生物發酵液中純化聚酮化合物, 然后進行化學分析仍是發現新型聚酮化合物的主要策略, 隨著研究的進行, 盡管篩選微生物的范圍從陸地拓展到了海洋, 重復發現率仍越來越高, 越來越難發現新的聚酮化合物, 因此, 亟待開發更為快速有效的新型聚酮化合物篩選策略[4-5]。

基因組發掘(Genome mining)是利用現代生物信息學手段從基因組序列中尋找和識別特定功能基因或基因簇的技術[6]。基因組發掘表明, 即使是對天然被廣泛研究的細菌而言, 發現的次級代謝產物種類也遠遠低于基因組發掘獲得的次級代謝產物基因簇[7-8]。隨著基因測序技術的飛速發展, 基因組序列測定速度提高, 成本降低, 海量的微生物基因組序列和宏基因組序列被測定[9]。通過基因組發掘技術發掘天然產物基因簇技術發展迅速, 促使基因組發掘成為更加準確高效的新型聚酮化合物篩選策略[10]。通過基因組發掘技術, 越來越多的新穎基因簇被發掘, 從而引導大量的新型聚酮化合物被發現和研究[11-12]。新穎基因簇既為異源表達提高次級代謝產物生產效率奠定基礎, 也為闡明活性物質代謝途徑, 從而通過代謝工程為提高生產效率奠定基礎, 同時又為通過組合生物合成技術對化合物結構進行改造提供了基因序列信息[13]。

目前, 已知的具有生物活性的聚酮類化合物的2/3是放線菌產生的[3]。海洋放線菌代謝產物的結構和活性多樣更加豐富多樣[14]。2005年, 首個專性海洋放線菌屬鹽孢菌屬 (Salinosporasp.) 報道, 該屬放線菌可以產生豐富的聚酮化合物[8]。2007年, 菌株S.tropicaCNB440 和菌株S.arenicolaCNS-205基因組序列被測定, 是專性海洋放線菌的首次全基因組測序, 打開了海洋放線菌基因組發掘之門。對兩個菌株的基因組序列進行發掘, 共發現了包括PKS、NPRS、siderophore、melanin、terpenoid 和 aminocyclitol 等 49 個次生代謝產物基因簇 (Orphan gene cluster), 其中, 只有9個基因簇發現了代謝產物[15]。根據獲得基因簇信息, Moore 研究組從鹽孢菌屬放線菌發現了Salinosporamide K[16], Lomaiviticin[17]和 Cyanosporasides C-F[18]。菌株S.arenicolaCNP-193 具有良好的抗菌活性, 利用 molecular networking技術對 35株鹽孢菌屬菌株進行測定, 發現菌株CNP193能產生不同于其他菌株的新穎代謝產物。因此, 作者以S.arenicolaCNS 205 基因組中含有的基因簇為參照, 發掘菌株S.arenicolaCNP193 基因組中新穎的 PKS 和 NRPS 基因簇, 并對基因簇進行比較分析, 為基因簇的異源表達, 基因簇的功能鑒定及新型聚酮化合物的發現提供信息。

1 材料與方法

1.1 新穎PKS 和NRPS 基因簇發掘

將S.arenicolaCNS 205基因組序列和S.arenicolaCNP193 基因組序列提交 antiSmash 在線網站(http: //www.secondarymetabolites.org/)預測和分析次級代謝產物基因簇, 通過 NRPS-PKS knowledgebase (http: //www.nii.ac.in/~pksdb/sbspks/master.html)對預測結果進行驗證后, 初步篩選出二者不同的PKS及NRPS基因簇[10]。進一步利用NCBI BLAST對初篩新穎基因簇的基因序列進行比對分析, 獲取沒有較高基因序列相似性的基因簇[12]。利用 NapDos(http: //napdos.ucsd.edu/) 對基因簇中的 KS domain和 C domain 的進化進行分析[9]。

1.2 新穎PKS 和NRPS 基因簇的功能預測

根據 antiSmash搜索已知功能的同源基因簇,并預測基因簇中生合成基因對應產物的核心結構,初步判斷基因簇代謝產物, 利用NCBI BLAST對基因簇所有同源序列進行搜索, 最后利用NapDos對基因簇中的 KS domain 和 C domain 的進化進行分析, 獲悉 KS domain 和 C domain 的催化功能, 綜合確定產物的類型及結構信息。

2 結果

2.1 S.arenicola CNP193 基因組中PKS 和NRPS 基因簇預測與分析

通過 antiSmash 預測, 并經過 NRPS-PKS knowledgebase 進一步驗證的S.arenicolaCNP193 基因組中次級代謝產物基因簇如表1。在菌株S.arenicolaCNP193 基因組序列中共發現次級代謝產物基因簇23個, 其中t1PKS 基因簇4個, t2PKS 基因簇和 t3PKS 基因簇各 1 個, NRPS 基因簇3個, NRPSPKS基因簇2個。

2.2 S.arenicola CNP193 基因組中新穎PKS和NRPS 基因簇的篩選

菌株S.arenicolaCNS 205基因組序列中共有次級代謝產物基因簇 25 個, 其中 t1PKS 基因簇7 個, t2pks 基因簇和 t3PKS 基因簇各1個, NRPS基因簇 4 個, NRPS-PKS 基因簇2個。Nett等[15]報道菌株S.arenicolaCNS 205中已經明確功能的基因簇有5個, 對應產物分別為 利福霉素、星孢菌素、去鐵敏、Lymphostin 和Cyclomarin。根據Nett等[15]報道基因簇信息和 antiSmash 推測的S.arenicolaCNS 205基因組中的次級代謝產物基因簇, 找到S.arenicolaCNS 205中5個明確基因簇功能的包括編號, 產物類型和大小等基因簇信息, 并了解基因簇的結構組成 (圖1) 。根據這些信息從菌株S.arenicolaCNP193基因組中尋找產物類型相同, 大小和結構組成相似度較高的基因簇。中和S.arenicolaCNS 205中5個明確功能的基因簇均能在菌株S.arenicolaCNP193中找到對應的基因簇 (表2)。除Rifamycin 基因簇外, 兩菌株中星孢菌素、去鐵敏、Cyclomarin 和 Lymphostin的基因簇大小相同, 結構組成基本相同, 序列相似度高于 99%。雖然菌株S.arenicolaCNS 205 中利福霉素 基因簇較菌株S.arenicolaCNP193中對應的基因簇大20 kb, 但是S.arenicolaCNP193與對應大小S.arenicolaCNS 205中的基因簇相似性高達 99%。且二者 antiSmash 在線預測兩個基因簇的核心結構只是在中間位置有 3個組成單位不同(圖2), 因此推測S.arenicolaCNP193的基因簇產物屬于Rifamycin同系物。

根據基因簇產物類型, 大小和結構組成, 以及antiSmash 在線預測的基因簇產物核心結構, 判斷菌株S.arenicolaCNP 193基因組中基因簇是否在S.arenicolaCNS 205 中有相同的基因簇, 發現S.arenicolaCNP193 基因組中具有四個與S.arenicolaCNS 205 不同的基因簇, 分別為基因簇7, 基因簇 8, 基因簇 10和基因簇 20(表1)。利用 NCBI BLAST 對初篩新穎基因簇的基因序列進行比對分析(圖3)。基因簇8中98%的序列和S.arenicolaCNS205 中包含基因簇 8的部分序列的相似性高達達到99%; 基因簇 7同Micromonospora echinospora的卡里奇霉素基因簇相似性最高, 基因簇 7 中 67%的序列同該序列的相似性為到 81%; 62% 的基因簇10 同S.arenicolaCNS 205 基因組中序列相似性為98%; 基因簇 20 中有 26% 的序列同S.arenicolaCNS 205 基因組中序列相似性為 99%。表明S.arenicolaCNP193基因組中所具有的新穎 PKS和NRPS 基因簇為基因簇7, 基因簇10和基因簇20。

表1 菌株S.arenicola CNP193和菌株S.arenicola CNB 440 基因組序列中的次級代謝產物基因簇Tab.1 The secondary metabolite gene clusters mined from S.arenicola CNP193 and S.arenicola CNB 440

圖1 菌株 S.arenicola CNP193和菌株 S.arenicola CNS 205 基因組序列中已知功能次級代謝產物基因簇結構組成Fig.1 Modular organization of the gene clusters from S.arenicola CNP193 and S.arenicola CNS 205

表2 菌株 S.arenicola CNP193和菌株 S.arenicola CNS 205 基因組序列中已知功能次級代謝產物基因簇信息比較Tab.2 Information comparison of the gene clusters from S.arenicola CNP193 and S.arenicola CNS 205

圖2 antiSmash 在線預測菌株 S.arenicola CNP193和菌株 S.arenicola CNS 205 基因組序列中利福霉素基因簇核心結構Fig.2 The core structure of Rifamycin predicting with antiSmash based on gene cluster of S.arenicola CNP193 and S.arenicola CNS 205

圖3 Blast搜索基因簇同源序列Fig.3 Homologous gene clusters searching with Blast

2.3 基因簇7

基因簇 7 屬于 t1PKS, 位于基因組的 2036897–2082794, 長度約為 46 kb。基因簇的構成見圖4。antiSmash 預測已知功能同源關系最近的基因簇序列為卡里奇霉素, maduropeptin和新制癌菌素, 都屬于烯二炔化合物(圖5)。NCBI BLAST對基因組序列進行比對分析, 表明基因簇 7 同M.echinospora的 卡里奇霉素 基因簇相似性最高, 基因簇 7 中67% 的序列同該序列的相似性達到 81%。而只是同S.arenicolaCNS 205 和S.tropicaCNB 440 只是在基因簇的兩端有較高的重復序列(圖3)。利用 Nap-Dos 對圖3 所示的基因簇中的 KS domain 蛋白序列進行同源性分析, 結果見表3。該 KS domain 和M.echinospora菌株的 卡里奇霉素基因簇中的 CALEAM_AAM94794_ene10 (KS domain)蛋白質序列相似性為89%, 屬于烯二炔家族, 由 Ahlert 等 2002 年報道[19]。初步表明基因簇7為烯二炔類化合物基因簇。

2.4 基因簇10

基因簇10 屬于寡糖-t1pks-nrps-五肽, 位于基因組的 2254459–2343659, 長度為 89.2 kb。基因簇的構成見圖6, 基因簇中含有 ER domain, KS domain,AT domain 和 DH domain 各一個; A結構域和C結構域各兩個。antiSmash 預測沒有發現已知功能同源基因簇序列。NCBI BLAST對基因組序列進行比對分析結果見表4, 62% 的基因簇 10 同S.arenicolaCNS 205 基因組中序列相似性為 98%, 30% 的基因簇 10 同M.echinospora基因組中序列相似性為98%。對基因簇中KS domain和C domain的蛋白序列利用NapDos分析, 結果見表5。和基因簇7中的KS domain 類似, 該 KS domain和M.echinospora菌株的 卡里奇霉素 基因簇中的 KS domain 蛋白質相似性為 88%。兩個C domain均屬于LCL家族, 同S.tropica合成 sporolide A 的基因簇中的C domain 的相似性分別為 34%和43%。

2.5 基因簇20

基因簇 20 屬于 NRPS-t1PKS, 位于基因組的3923744–3981049, 長度約為57.3 kb。基因簇的構成見圖7, 基因簇中含有C domain 4個, A domain 3個。雖然 antiSmash 預測沒有發現已知功能同源基因簇序列, 但是成功的預測了基因簇對應產物的核心結構為三個半胱氨酸縮合物(圖8)。NCBI BLAST對基因組序列進行比對分析, 26% 的基因簇序列同S.arenicolaCNS 205 基因組中序列相似性為 99%,5% 的基因簇序列 同Verrucosispora marisAB-18-032 基因組中序列相似性為 80%。對基因簇中KS 結構域和C結構域的蛋白序列利用在線工具NapDos分析, 結果見表6。KS1 domain 屬于雜和KS domain, 同菌株Sorangium cellulosumSo ce90產 epothilone 基因簇中的編號為 EpoC_Q9L8C8_H的 KS domain[20]的相似度達58%。C1 domain 和Bacillus licheniformisATCC 10716產bleomycin的bacit1_C1_cyc domain[21]相似度為 36%; C2, C3,C4均和Streptomyces verticillusATCC15003 的bleom9_C2_cyc domain[22]相似度分別為45%, 44%和 46%。

圖4 基因簇7的結構組成Fig.4 Modular organization the gene cluster 7

圖5 antiSmash比對獲得的基因簇7同源基因簇Fig.5 The Homologous gene clusters searching with antiSmash

表3 NapDos分析基因簇7中KS domain 的同源蛋白序列Tab.3 Homologous protein sequences of KS domain from gene cluster 7 searching with NapDos

圖6 基因簇10結構組成Fig.6 Modular organization of the gene cluster 10

表4 NCBI blast 基因簇10同源序列Tab.4 Homologous sequences of gene cluster 10 with NCBI blast

表5 NapDos分析基因簇10中KS domain h和C domain 的同源蛋白序列Tab.5 Homologous protein sequences of KS domain and C domain from gene cluster 10 searching with NapDos

3 討論

3.1 PKS及NRPS 基因簇的挖掘

基因組挖掘技術在搜尋新穎微生物次級代謝產物方面優勢明顯, 聚酮 (Polyketide) 化合物具有多種生物活性, 是新藥開發的最重要前體化合物之一,因此通過基因組發掘技術發掘新穎PKS及NRPS基因簇成為研究熱點。有關PKS及NRPS基因的數據庫, 發掘新穎PKS及NRPS的軟件和在線網站逐年增多, 即可以對基因框架, 宏基因組序列, 以及整個基因組范圍內的PKS及NRPS基因簇進行篩選, 對基因簇的進化及來源進行探索, 又可以對基因簇的組成結構進行分析, 對代謝產物結構初步預測[23-24]。

圖7 基因簇20結構組成Fig.7 Modular organization of the gene cluster 20

表6 NapDos分析基因簇20中KS domain h和C domain 的同源蛋白序列Tab.6 Homologous protein sequences of KS domain and C domain from gene cluster 20 searching with NapDos

圖8 antiSmash 在線預測基因簇20對應產物的核心結構Fig.8 The core structure of gene cluster 20 predicting with antiSmash

發掘的技術核心是在收集盡量多的 PKS及NRPS基因簇序列信息, 在分析不同基因簇的結構組成, 催化單元, 相關酶及底物高級結構的基礎上, 利用對基因或蛋白序列的多重比對, 以及不同的運算法則對功能結構域進行檢索分析, 從而識別待測基因組中PKS及NRPS基因簇, 并對其功能進行推測[25]。Antismash 是美國, 德國, 英國及和荷蘭等研究者開發的微生物次級代謝代謝產物預測及分析網站, 幾經升級, 可以對包括PKS及NRPS在內的次級代謝產物基因簇進行識別和分析[10]。NRPS-PKS knowledgebase是專門的 NRPS, PKS數據庫, 用于分析NRPS, PKS和NRPS/PKS雜合基因簇及其結構等。因此, 本研究在利用 antiSmash 識別篩選基因簇的基礎上, 利用NRPS-PKS knowledgebase驗證, 提高基因簇預測的準確性。

3.2 基因簇的新穎性確定

基因簇的新穎性是指基因簇生物合成基因, 調控基因等基因本身或排布不同, 從而更趨向于合成新穎的代謝產物。以S.arenicolaCNS 205為對照, 利用同一網站對S.arenicolaCNP-193基因簇的發掘,比較基因簇的結構結合基因簇的大小, 可以最大限度的去除相同基因簇。S.arenicolaCNS 205的基因簇8比S.arenicolaCNP-193基因簇9大接近20 kb,但是大部分組成結構相近, 認為是相同基因簇。S.arenicolaCNP-193中, 基因簇 8(2128462-2175754)和基因簇 9(2159970-2225471)有約 16Kb的重合區域。這是由于antiSmash最大程度的預測可能次級代謝產物基因簇, 部分基因序列和其前后的基因序列都能形成基因簇, 因此會有預測基因簇重合現象。

通過NCBI Blast 比對獲得基因簇基因序列, 發現S.arenicolaCNP-193基因簇8中98%的序列和S.arenicolaCNS 205中包含部分基因簇8的序列相似性高達達到99%。說明S.arenicolaCNP-193基因簇8不具新穎性, 同時也表明S.arenicolaCNP-193基因簇8沒有在S.arenicolaCNS 205預測為次級代謝產物基因簇, 是由于其部分序列包含在了S.arenicolaCNS 205中基因簇9中。基因簇10和基因簇20和其他基因序列的同源性較低。通過NapDos比對基因簇中KS domain和C domain的蛋白序列, KS domain與其他KS domain蛋白質序列相似性低于80%,C domain 與其他C domain 蛋白質序列相似性低于50%, 進一步證明基因簇的新穎性。

3.3 新穎基因簇的對應產物預測

基因簇對應產物可以通過搜索基因或蛋白同源序列進行預測, 也可以根據基因簇中生物合成基因的構成及其編碼酶的催化功能進行預測。antiSmash,NCBI Blast以及NapDos對基因簇中的KS domain的比對分析都表明基因簇7和M.echinospora菌株的卡里奇霉素有最高同源性。卡里奇霉素結構見圖9, 屬于烯二炔類抗腫瘤抗生素。烯二炔類抗生素對腫瘤細胞有強烈的殺傷作用。一般比阿霉素、絲裂霉絲等強1000倍以上。作為新型抗腫瘤物質, 烯二炔類抗生素受到廣泛重視[26]。Scripps海洋研究所生物技術與生物醫藥研究中心從于2006年從S.pacifica發酵產物中分離了烯二炔類化合物 cyanosporasides A-B, 2013年, 分離獲得了 cyanosporasides C-F, 并對產生該類化合物的基因簇基因簇進行了比較和結構分析[18]。除此以外, 尚未從Salinispora屬發現新的烯二炔類化合物。基因簇 7 的發現, 表明S.arenicolaCNP193有可能產生新穎的烯二炔類抗腫瘤抗生素。

圖9 卡里奇霉素結構Fig.9 The structure of calicheamicin

antiSmash, NCBI Blast沒有發現已知功能的同源基因簇。NapDos對基因簇10中的KS domain和C domain的比對分析都表明, KS domain 和M.echinospora菌株的卡里奇霉素基因簇中的 KS domain有最高同源性, 兩個C domain 均屬于LCL家族, 同S.tropica合成sporolide A的基因簇中的C domain 同源。但是根據這些信息, 尚不能預測相應產物結構。

antiSmash預測了基因簇 20不考慮是否發生環化反應是的核心結構, 由半胱氨酸縮合而成。KS domain和C domain和EpoC_Q9L8C8_H, bacit1_C1_cyc, bleom9_C2_cyc相似度最高, 分別在合成埃博霉素 A, 桿菌肽 A以及博來霉素的中催化半胱氨酸之間及半胱氨酸與其他氨基酸之間的縮合成噻唑環。埃博霉素 A為大環內酯類抗癌藥物[24], 桿菌肽 A為抗菌脂肽[25], 博來霉素為糖肽抗癌藥物[26]。三者結構見圖10, 均具有噻唑環, 因此可初步摧測基因簇20對應產物為含有噻唑環, 有半胱氨酸及其他氨基酸參與合成的肽類化合物。

圖10 埃博霉素A, 博來霉素和桿菌肽A的結構Fig.10 The structure of epothilone A, bleomycin, and bacitracin

致謝:

感謝加州大學圣地亞哥分院Scripps海洋研究所生物技術與生物醫藥研究中心 Jensen R Paul 教授提供菌株Salinispora arenicolaCNP193基因組信息。

[1]Winter J M, Tang Y.Synthetic biological approaches to natural product biosynthesis[J].Current Opinion in Biotechnology, 2012, 23: 736-743.

[2]楊建, 洪葵.宏基因組文庫技術獲得聚酮化合物[J].遺傳, 2006, 28(10): 1330-1336.

[3]Manivasagan P, Venkatesan J, Sivakumar K, et al.Marine actinobacterial metabolites: current status and future perspectives[J].Microbiological Research, 2013,168: 311-332.

[4]Oman T J, van der Donk W A.Follow the leader: the use of leader peptides to guide natural product biosynthesis[J].Nature Chemical Biology, 2010, 6: 9-18.

[5]Lane A L, Moore B S.A sea of biosynthesis: marine natural products meet the molecular age[J].Natural Product Reports, 2011, 28: 411-428.

[6]Kersten R D, Yang Y L, Xu Y, et al.A mass spectrometry-guided genome mining approach for natural product peptidogenomics[J].Nature Chemical Biology,2012, 7: 794-802.

[7]Bentley S D, Chater K F, Cerdeno-Tarraga A M, et al.Complete genome sequence of the model actinomyceteStreptomyces coelicolorA3(2) [J].Nature, 2002, 417:141-147.

[8]Udwary D W, Zeigler L, Asolkar R N, et al.Genome sequencing reveals complex secondary metabolome in the marine actinomyceteSalinispora tropica[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, 104:10376-10381.

[9]Ziemert, N, Podell S, Penn K, et al.The natural product domain seeker NaPDoS: a phylogeny based bioinformatic tool to classify secondary metabolite gene diversity[J].PloS One, 2012, 7: e34064.

[10]Blin K, Medema M H, Kazempour D, et al.antiSMASH 2.0—a versatile platform for genome mining of secondary metabolite producers[J].Nucleic Acids Research,2013, 21: 204-212.

[11]Wu J, Li L, Deng Z, et al.Analysis of the mildiomycin biosynthesis gene cluster in Streptoverticillum remofaciens ZJU5119 and characterization of MilC, a hydroxymethyl cytosyl-glucuronic acid synthase[J].Chem Bio Chem, 2012, 13(11): 1613-1621.

[12]Velasquez J E , van der Donk W A.Genome mining for ribosomally synthesized natural product[J].Curr Opin Chem Biol, 2011, 15: 11-21.

[13]McGlinchey R P, Nett M, Eustaquio A S, et al.Engineered biosynthesis of antiprotealide and other unnatural salinosporamide proteasome inhibitors[J].Journal of the American Chemical Society, 2008, 130: 7822-7824.

[14]Lane A L, Moore B S.A sea of biosynthesis: marine natural products meet the molecular age [J].Natural Product Reports, 2011, 28: 411-428.

[15]Nett M, Ikeda H, Moore B S.Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes[J].Natural Product Reports, 2009, 26: 1362-1384.

[16]Kersten R D, Lane A L, Nett M, et al.Bioactivityguided genome mining reveals the lomaiviticin biosynthetic gene cluster inSalinispora tropica[J].Chem Bio Chem, 2013, 14: 955-962.

[17]Eustaquio A S, Nam S, Penn K, et al.The Discovery of Salinosporamide K from the marine bacterium “Salinispora pacifica” by genome mining gives insight into pathway evolution[J].Chem Bio Chem 2011, 12: 61-64.

[18]Lane A L, Nam S J, Fukuda T, et al.Structures and comparative characterization of biosynthetic gene clusters for cyanosporasides, enediyne-derived natural products from marine actinomycetes[J].Journal of the American Chemical Society, 2013, 135: 4171-4174.

[19]Ahlert J, Shepard E, Lomovskaya N, et al.The calicheamicin gene cluster and its iterative Type I enediyne PKS[J].Science, 2002, 297: 1173-1176.

[20]Konzl D, Klensl A, Schbrgendorfer K, et al.The bacitracin biosynthesis operon ofBacillus licheniformisATCC 10716: molecular characterization of three multi-modular peptide synthetases[J].Chemistry Biology, 1997, 4: 927-937.

[21]Du L, Sanchez C, Chen M, et al.The biosynthetic gene cluster for the antitumor drug bleomycin from Streptomyces verticillus ATCC15003 supporting functional interactions between nonribosomal peptide synthetases and a polyketide synthase[J].Chemistry Biology, 2000, 7: 623-642.

[22]Molnár I, Schupp T, Ono M, et al.The biosynthetic gene cluster for the microtubule-stabilizing agents epothilones A and B from Sorangium cellulosum So ce90[J].Chemistry Biology, 2000, 7: 97-109.

[23]Jensen P R, Williams P G, Oh D C, et al.Speciesspecific secondary metabolite production in marine actinomycetes of the genusSalinispora[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73: 1146-1152.

[24]姚琳, 郭東林.PKS-NRPS數據庫的研究進展[J].中國農學通報, 2009, 25(16): 280-283.

[25]Nikolouli K, Mossialos D.Bioactive compounds synthesized by non-ribosomal peptide synthetases and type-I polyketide synthases discovered through genome-mining and metagenomics[J].Biotechnology Letters, 2012, 34: 1393-1403.

[26]李麗, 顧覺奮, 吳梧桐.烯二炔類抗腫瘤抗生素單克隆抗體導向藥物研究進展[J].藥物生物技術, 2006,12(4): 275-277.