以產朊假絲酵母為原料生產風味酵母抽提物工藝的研究

葉 茂，鄧毛程，張遠平，李 靜，張東峰

(廣東輕工職業技術學院食品與生物工程系，廣東廣州510300;廣東高校特色調味品工程技術開發中心，廣東廣州510300)

酵母抽提物(yeast extract，YE)是利用啤酒廢棄酵母及鮮酵母等為原料，通過生物酶解技術獲得的一類具有醇厚味美的調味產品。酵母抽提物不但具有強烈的呈味性能，能起到增加食品呈香和味覺的效果，廣泛應用于肉制品、干酪烘焙食品、調味料、湯料、蔬菜和海鮮風味產品以及香精香料等行業中，而且還含有豐富的多肽、氨基酸、核苷酸、B族維生素、礦物質、微量元素等，能起到營養和醫療輔助作用。因此，酵母抽提物是一種兼具調味、營養和保健三大功能的高級天然復合添加劑，具有廣泛的應用前景［1-2］。產朊假絲酵母(Candida utilis)作為一種一般認為安全(generally regarded as safe，GRAS)生物，它和啤酒酵母、克魯維酵母被美國食品及藥物管理局(FDA)認證為可作為食品添加劑的酵母，也是我國衛生部規定的可用于保健食品的真菌菌種［3］。因此，產朊假絲酵母常常被用于生產多種功能物質，是工業中極為重要的微生物之一。

產朊假絲酵母作為酵母抽提物的原料具有一定的優勢，其所含蛋白質和核酸物質均高于一般的面包酵母和啤酒酵母，并且酵母味較淡。因此，國外已經有產朊假絲酵母為原料的酵母抽提物產品(如，巴西Biorigin、加拿大 Lallemand、日本 Kohjin等)。然而，目前國內酵母抽提物生產所用酵母基本都是面包酵母和啤酒酵母的釀酒酵母屬(Saccharomyces cerevisiae)［4］。本文研究內容是以產朊假絲酵母為原料的風味酵母抽提物制備工藝，所得酵母抽提物可作為風味食品的加工原料。這為我國的酵母抽提物企業開發新產品提供了一條新思路。

表2 酵母抽提物的感官評定Table 2 Assessing method of flavor yeast extract

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產朊假絲酵母(Candiada utilis，No．1769) 中國工業菌種保藏中心(CICC);木瓜蛋白酶(107U/g)、菠蘿蛋白酶(5×106U/g)、中性蛋白酶(106U/g)、風味酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司;其他試劑國產分析純。

GJB300-100高壓均質機 常州市均質機械有限公司;HHS水浴振蕩器 上海博迅實業有限公司;809型萬通自動電位滴定儀 瑞士萬通公司;722N型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 實驗流程 產朊假絲酵母→接種培養→離心收集酵母泥→配制一定濃度酵母懸浮液(并調節pH)→NaHCO3預處理→高壓均質破壁→自溶(添加酶制劑)→加熱滅酶活(85℃，15min)→離心分離(6000r/min，10min)→收集上清液→取樣測定。

1．2．2 提取工藝最優參數的確定 在單因素實驗時，依次改變提取均質壓力、均質次數、溫度、pH、外加蛋白酶的種類及添加量、自溶時間，以酵母抽提物的上清氨基態氮含量、得率及感官評定作為評價指標進行研究和分析，并設計五因素四水平的正交實驗分析確定最佳提取參數，選用L16(45)正交實驗表(見表1)。

表1 酵母自溶條件優化的因素和水平Table 1 Factor and levels of orthogonal test of autolysis conditions

1．2．3 測定方法 氨基酸態氮(free amino acid nitrogen，FAN)、固形物(不溶物)含量的測定:參照《GB/T 23530-2009酵母抽提物》中的檢測方法進行測定［5］。得率公式［6］如下:

得率(%)=上清總重×上清液固形物-外加物質干重/自溶前酵母干重×100

感官鑒定:由10人對酵母抽提物的風味進行感官評定，對其風味強弱(濃、中、淡)情況、香氣情況(醬香、不良氣味等情況)進行文字描述，見表2，綜合分析10人的描述，作為其感官鑒定的結果［7］。

1.3 數據處理

所有數據用SPSS16．0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 高壓均質對酵母自溶的影響

高壓均質對于酵母細胞壁有很好的破壁作用，可破壞酵母細胞的結構，導致細胞結構發生紊亂，加速酵母的自溶，并且與酶法處理相比，高壓均質更適合于工業化生產［8］。

2．1．1 均質壓力對酵母自溶的影響 均質壓力對酵母自溶的影響結果見圖1。從圖1看來，當均質壓力為0～75MPa時，氨基態氮和得率隨均質壓力提高呈現逐漸遞增，當均質壓力超過75MPa后，上清液氨基氮總量幾乎不再增加，75MPa下均質的得率與100MPa的差別不大。

圖1 均質壓力對酵母自溶的影響Fig．1 Effect of homogeneous pressure on yeast autolysis

2．1．2 均質次數對酵母自溶的影響 從圖2可以看出，隨著均質次數的增加，特別均質2次和3次，其得率及上清液氨基氮總量較均質1次有大幅度的提高，而均質2次與均質3次相比，均質3次的得率及上清液氨基氮總量不再顯著上升。因此，均質2次即可得到最大得率及上清液氨基氮總量。

圖2 均質次數對酵母自溶的影響Fig．2 Effect of homogeneous number on yeast autolysis

2.2 溫度對酵母自溶的影響

由圖3可知，溫度對酵母自溶的影響較大，在溫度為55℃時，氨基酸態氮含量及得率均達到最大值，因此選擇55℃為最佳自溶溫度。這與大部分酵母自溶溫度相一致，這可能是酵母自溶過程中起主要作用的內源蛋白酶的最適作用溫度基本在45～60℃左右［9］。

圖3 溫度對酵母自溶的影響Fig．3 Effect of temperature on yeast autolysis

2.3 pH對酵母自溶的影響

由圖4可知，當pH為6．0時，氨基酸態氮含量及得率均達到最大值，分別為581mg/100mL和39．7%，故選定酵母自溶的最適pH為6．0。

圖4 pH對酵母自溶的影響Fig．4 Effect of pH on yeast autolysis

2.4 添加蛋白酶對酵母自溶的影響

2．4．1 蛋白酶的篩選 對適合酵母抽提物的蛋白酶篩選結果見表3。由表3可知，添加蛋白酶都能提高氨基酸態氮含量與得率，其中添加酸性蛋白酶的氨基態氮含量最高，比對照提高7．4%;添加復合風味酶的得率最高，比對照提高16．7%。同時經過感官評定，添加風味酶的產品風味最為濃郁，并且具有醬香和酯香。因此綜合評價，在酵母自溶過程中選擇添加復合風味酶。

2．4．2 風味酶添加量的確定 結果見表4所示，風味酶添加量為1．0%時，得率達到最大，氨基態氮含量與添加量為1．5%時的氨基態氮含量相近，繼續增大加酶量，得率反而有所降低，推測原因可能是酶量的增大導致酵母前期水解速度加快，溶液pH下降較快，從而降低了酵母內源酶的活性［6］。同時，添加量為1．5%的樣品風味非常濃郁，且帶有醬香和酯香，故選定風味酶的添加量為1．5%。

2.5 時間對酵母自溶的影響

隨著時間的延長，氨基酸態氮含量、得率和風味都逐步提升，當24h之后增長幅度明顯減緩，在48h時氨基態氮含量最高，風味濃郁;當進行到48h之后雖然得率仍在上升，但氨基態氮含量開始下降，同時出現了不良風味(見表5)。可能原因是酵母細胞中一些脫羧或脫氨酶，進一步將氨基酸分解成了小分子物質，導致氨基態氮含量下降，并產生一些不良風味［7］。通過對抽提液的氨基態氮、得率及感官評定等因素的綜合考慮，自溶時間控制在48h為最佳。

2.6 酵母自溶條件的優化

設計5因素4水平的正交實驗，以得率作為實驗結果的衡量指標，通過極差分析及方差分析優化酵母自溶的最佳條件，結果見表6和表7。

由表7可知，根據方差分析得出結論為均質壓力、溫度、pH、添加風味酶和時間5個因素的各水平間均有差別。其中，pH和溫度因素對酵母抽提物得率的影響極顯著(p＜0．01)，均質壓力和風味酶因素對酵母抽提物得率的影響顯著(p＜0．05)，時間因素對酵母抽提物得率的影響不顯著。并且各因素對抽提物得率的影響順序是pH＞溫度＞風味酶＞均質壓力＞時間。同時由極差分析結果可知酵母抽提物得率最高的條件為:均質壓力75MPa、溫度50℃、pH6．5、風味酶 1．5% 及自溶時間 48h。

表3 添加蛋白酶對酵母自溶的影響Table 3 Effect of addition of proteases on yeast autolysis

表4 不同添加量風味酶對酵母自溶的影響Table 4 Effect of different addition amount of flavourzyme on yeast autolysis

表5 時間對酵母自溶的影響Table 5 Effect of different time on yeast autolysis

表6 酵母自溶條件優化正交實驗設計表L16(45)及實驗結果Table 6 Orthogonal design and results L16(45)

表7 得率的方差分析Table 7 Variance analysis of yield of yeast extract

按照以上優化后的最佳自溶條件，進行驗證實驗，重復三次，均獲得50．1%以上酵母抽提物得率，并且氨基態氮含量可達650．6mg/100mL。同時對其進行感官評定，酵母抽提物外觀呈紅褐色，有醬香并略帶酯香，口感濃郁有鮮甜味。

3 結論

本研究以產朊假絲酵母為原料制備酵母抽提物，確定的酵母自溶最佳工藝條件為:以15%濃度的酵母懸浮液，75MPa壓力下循環均質2次后，調初始pH6．5，并添加 1．5%(w/w)的風味酶，溫度 50℃下水浴自溶48h，所得酵母抽提物的氨基態氮含量為650．6mg/100mL，抽提物得率為 50．1%，該酵母抽提物有醬香并略帶酯香，口感濃郁有鮮甜味。

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