以雞蛋殼為鈣源制備谷氨酸螯合鈣工藝研究

彭亦谷，趙彩鐲，胡 榮，馬宇熙，王子榮

(新疆農業大學食品與藥品學院，新疆烏魯木齊830052)

鈣是人體內必需的元素之一，它是構成人體骨骼、牙齒、器官、血液、肌肉組織的重要成分，當人體中缺乏鈣可能發生生理功能障礙［1-2］。氨基酸螯合鈣是一個或者多個氨基酸基團與金屬鈣發生配合反應形成的具有環狀結構的化合物。其具有良好的化學和生化穩定性，易于被人體吸收、副作用小、生物利用率高［3-4］，能達到既補充氨基酸又補充鈣的雙重功效，是一種較理想的鈣營養強化劑［5-6］。而蛋殼中含有豐富的鈣，從畜牧學角度分析它是一種完全高度結合的生物鈣源，天然、安全［7］。H．Z．Walton 對沒經過水洗處理的雞蛋殼中所含化學元素進行測定，發現其中鈣含量高達36．4%［8］，并且還有一些機體必要微量元素。按蛋殼占蛋重的12%～13%［9］進行計算，近些年來我國每年扔掉的雞蛋殼達400×104t［10］左右，對環境造成污染以及資源的極大浪費。這迫切需要新技術手段來對蛋殼進行營養資源化利用，既可以變廢為寶，高價值化利用蛋殼，又可以解決蛋殼對環境造成的污染;活躍我國鈣制劑市場，改善我國居民缺鈣的現狀。因此研究以雞蛋殼為鈣源制備谷氨酸螯合鈣的技術具有較高的實際意義和開發價值。

目前，對蛋殼鈣源的利用制備鈣制劑主要是乳酸鈣、檸檬酸鈣及蘋果酸鈣等第二代鈣制劑，主要采用酸解提取可溶性鈣、高溫煅燒法，方法普遍存在造成酸污染以及環境污染，有機溶劑殘留等缺陷［11-12］，而本實驗采用雞蛋殼與氨基酸直接反應制取氨基酸螯合鈣，這種研究方法報道較少，相對于前者具有綠色環保，工藝簡便易行等優點。氨基酸螯合鈣是第三代鈣制劑鈣元素可以通過小腸絨毛刷狀緣，以氨基酸或肽的形式直接從腸黏膜吸收，有效避免一些理化因子的影響，如pH、脂類、纖維、草酸、植酸等的影響，其生物學利用率高，從而有效解決傳統鈣制劑產生的溶劑性差、吸收利用低、產生結石等問題。因此，本實驗采用直接反應制取氨基酸螯合鈣法，對摩爾比、pH、螯合溫度、螯合時間4個參數進行響應面優化設計，獲得最佳工藝參數，以此為雞蛋殼的深度開發以及氨基酸螯合鈣制劑的綜合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料 雞蛋殼，收集于新疆農業大學學生食堂餐廳，蛋品種為海蘭褐雞蛋，收集時間清晨新鮮廢棄蛋殼;L-谷氨酸 北京博泰克生物基團技術有限責任公司;無水乙醇、EDTA二鈉鹽、三乙醇胺 天津市福晨化學試劑廠;鉻黑T 天津市致遠化學試劑有限公司;鹽酸 天津化學試劑三廠;氨水 四川西隴化工有限公司。

FW-100高速萬能粉碎機 北京市永光明醫療儀器廠;EYELA SB2000旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司;DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海恒科技有限公司;100目國家標準篩 上海東星建材實驗設備有限公司;AL204-IC電子分析天平 上海市梅特勒-托利多有限公司;數顯恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠;PHS-3c酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司;FOODALYT-TS10滴定儀 北京天翔飛域儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 原料預處理 蛋殼收集后，清水清洗表面雜物，沸水煮沸5～10min，超聲波殼膜分離，置100℃烘箱中烘干，粉碎過100目篩，4℃儲存備用。

1．2．2 谷氨酸螯合鈣制備工藝流程 谷氨酸、鈣源蛋殼粉和蒸餾水一定比例混合→調節pH→加熱→攪拌→保溫螯合→抽濾→上清液減壓濃縮置膏狀→乙醇沉淀→離心→收集沉淀物→干燥→粉碎→谷氨酸螯合鈣

1．2．3 谷氨酸螯合鈣螯合率的測定 稱取1．00g氨基酸螯合鈣樣品，溶于蒸餾水定容500mL，取100mL置300mL錐形瓶中，加入5滴1%鉻黑T指示劑和NH3·H2O-NH4Cl緩沖溶液 5mL 搖勻。0．01mol/L EDTA溶液滴定，平行進行3次滴定，記下消耗的EDTA溶液平均體積V0。另取相同量氨基酸螯合鈣樣品，加50mL無水乙醇，充分攪拌離心、分離、烘干，用蒸餾水定容至500mL，方法同上，記下消耗的EDTA溶液平均體積V1，由此計算出螯合率和金屬元素的總含量。

式中:C標定EDTA溶液的濃度mol/L;V1滴定螯合態鈣元素消耗的EDTA溶液體積mL;V0滴定鈣元素總量消耗的EDTA溶液體積mL;M為鈣元素的相對分子量g/mol;m為稱取的樣品量g。

1．2．4 影響螯合率的單因素實驗設計 通過單因素分別考察不同pH、摩爾配比、溫度、反應時間4個主要影響因素對氨基酸螯合鈣螯合率的影響，為響應面組合實驗各因素水平設計提供有意義的取值范圍。

1．2．4．1 摩爾比對螯合率的影響 分別以 4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 摩爾比，在 pH7、溫度 70℃的水浴中保溫螯合60min，考察不同摩爾比對螯合率的影響。

1．2．4．2 pH對螯合率的影響 調節混合液pH分別為 3、4、5、6、7、8、9、10，在摩爾比為 1∶3、溫度 70℃的水浴中保溫螯合60min，考察不同pH對螯合率的影響。

1．2．4．3 溫度對螯合率的影響 在 pH 為7，蛋殼粉與谷氨酸摩爾比為1∶3，螯合時間60min，選取螯合溫度 30、40、50、60、70、80、90、100℃。

1．2．4．4 時間對螯合率的影響 在 pH7、70℃、蛋殼粉與谷氨酸摩爾比為1∶3條件下，螯合溫度為30、40、50、60、70、80、90、100、110、120min 選取不同時間進行保溫螯合。

1．2．5 響應面的實驗設計 依據單因素實驗結果，選擇出最優條件范圍，通過Box-Behnken Design進行實驗設計，分析pH、摩爾配比、溫度、反應時間對響應值的影響，得出最佳工藝參數。實驗因素水平設計見表1，響應面設計數據及結果見表2。

表1 谷氨酸螯合鈣響應面實驗因素與水平Table 1 Experimental factors and levels

2 結果與分析

2.1 谷氨酸螯合鈣制備工藝條件的單因素實驗

2．1．1 蛋殼粉與谷氨基酸不同摩爾比對螯合率的影響 由圖1可知，在蛋殼粉與谷氨酸摩爾比從4∶1變化到1∶3的過程中，螯合率顯著增加，在摩爾比為1∶3時達到最高值;但隨著摩爾比調至1∶4、1∶5時，螯合率呈下降趨勢。這是因為碳酸鈣與谷氨酸反應合成谷氨酸螯合鈣，反應物的摩爾比理論值為1∶2，反應體系中谷氨酸與鈣源蛋殼粉中的CaCO3的摩爾比高，將有利于鈣離子的螯合完全，但是氨基酸利用率低，造成能源浪費，產品中鈣濃度低。

2．1．2 不同pH對谷氨酸螯合鈣螯合率的影響 由圖2可以看出，pH對螯合率有明顯影響，在pH由3上升到5過程中螯合率迅速減小，這可能是由于谷氨酸是酸性氨基酸，當其反應體系在酸性條件下時CaCO3直接先發生酸溶解反應從而有利于螯合率的提高。pH由5再上升到7時螯合率迅速增大，在pH8～10之間螯合率逐漸減低，pH為7時達到最大值，分析原因可能是當溶液中H+大量存在時，H+將會與Ca2+爭奪電子基團，不利于螯合物的形成，在pH為7時，氨基酸受H+和OH-影響較小，提供了充分的供電子基團，從而有利于鈣通過配位鍵形成螯合物［13-14］。

圖1 不同摩爾比對螯合率的影響Fig．1 Effects of different molar ratio of chelating rate

圖2 不同pH對螯合率的影響Fig．2 Effect of different pH on the chelating rate

2．1．3 不同溫度對谷氨酸螯合鈣螯合率的影響 由圖3可知，隨著溫度的提高，螯合鈣的螯合率增大，70℃時螯合率最高，但溫度進一步升高，螯合率呈下降趨勢，其原因可能是溫度過高而引起其他復雜反應導致產品質量減少。

圖3 不同溫度對螯合率的影響Fig．3 Effects of different temperature on the chelating rate

2．1．4 螯合時間對谷氨酸螯合鈣螯合率的影響 由圖4可知，隨著螯合時間的延長螯合率先增高后降低，當螯合時間為60min時，螯合率達到最大值，若時間進一步延長，螯合率有明顯的降低，可能是由于攪拌作用引起螯合物的降解，導致螯合率的降低。

2.2 響應面優化實驗

響應面實驗結果如表2所示。

表2 Box-Behnken Design實驗設計與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2．2．1 模型方差分析 表2是29個實驗點結果，29個實驗點分為兩類:一是析因點，自變量取值在A、B、C、D所構成的三維頂點，共有24個析因點;二是零點，為區域中心點，零點實驗重復5次，用來估計實驗誤差，以得率為響應值(Y)，利用DesignExpert8．0軟件進行二次多元回歸擬合，分別得到表3回歸方程模型方差分析及表4回歸方程系數顯著性分析。

表3 回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation model

由表3方差分析結果可看出，模型p＜0．0001，方程模型達到極顯著，失擬 p=0．7261 ＞0．05，不顯著，因此二次模型成立，應用此方程可以預測谷氨酸螯合鈣的螯合率及優化工藝。對表3中數據進行回歸擬合，得到自變量與螯合率率(Y)的二次多項回歸方程:Y=63．95+6．55A-1．98B-2．17C-0．51D+2．86AB+1．86AC+0．74AD+1．07BC-2．64BD-0．40 CD-8．96A2-6．77B2-4．06 C2-3．69D2

表4 回歸方程系數顯著性分析Table 4 Significance test for each regression coefficient of developed regression equation

由表4可知，影響氨基酸螯合鈣螯合率的因素主次為:摩爾比＞pH＞溫度＞時間。其中摩爾比、溫度及pH達到極顯著程度，螯合時間為顯著，且摩爾比與pH、摩爾比與溫度、pH與時間，pH與溫度有交互作用，達到極顯著水平。

2．2．2 響應面分析 谷氨酸螯合鈣制備工藝中摩爾比、溫度、pH、時間4個因素之間交互作用對螯合率的影響如下。

由圖5可知摩爾比與pH對螯合鈣的螯合率的影響均呈拋物線形，即隨摩爾比和pH同時增大，螯合率呈先增大后降低的趨勢，因此在制備工藝中適當增大摩爾比和pH可以提高螯合率。從圖6可以看出，隨著溫度和摩爾比值提高，螯合率也表現為先增大后緩慢降低，由此可見，適當的提高摩爾比及螯合溫度，可以一定程度提高螯合率。在圖7中，隨著時間和pH的增大，螯合率達到最大值;當時間和pH繼續增大時，螯合率緩慢降低，因此在實際生產中應控制pH和反應溫度在最佳范圍。從圖8中可知，隨著pH的增大和時間的延長，螯合率也不斷增加，但當達到一定值時，螯合率出現有下降的趨勢，控制好時間和pH的影響對實際生產有實際意義。

圖5 摩爾比和pH交互影響螯合率響應面圖(C=0，D=0)Fig．5 Response surface for the effect of cross-interaction between molar ratio and pH on chelating rate(C=0，D=0)

圖6 摩爾比與溫度交互影響螯合率響應面圖(B=0，D=0)Fig．6 Response surface for the effect of cross-interaction between molar ratio and temperature on chelating rate(B=0，D=0)

圖7 pH與時間交互影響螯合率響應面圖(A=0，C=0)Fig．7 Response surface for the effect of cross-interaction between pHand time on chelating rate(A=0，C=0)

2.3 最佳工藝參數確定及驗證性實驗

通過對2．2．1中模型方差分析得出最佳的工藝參數為:氨基酸與蛋殼粉摩爾比為 3．3∶1，pH 等于 6．9，螯合溫度為69．1℃，螯合時間60．1min，在此條件下螯合率為65．34%。為檢驗響應面法優化以雞蛋殼為鈣源谷氨酸螯合鈣工藝的可靠性，采用優化后的工藝條件進行驗證實驗，參考實際操作，將優化后的工藝參數調整為氨基酸與蛋殼粉摩爾比為3∶1，pH等于7，螯合溫度為70℃，螯合時間60min。在此最佳條件下，螯合率為(63．88 ±0．15)%，與模型預測值的誤差為 1．5%，接近預測值，說明實驗具有實際應用價值。

圖8 pH與溫度交互影響螯合率響應面圖(A=0，D=0)Fig．8 Response surface for the effect of cross-interaction between pH and temperature on chelating rate(A=0，D=0)

3 結論

通過單因素實驗和響應面設計，得出影響螯合率的工藝因素按主次順序為摩爾比＞pH＞溫度＞時間，制備最佳條件為:谷氨酸與蛋殼粉摩爾比為3∶1，pH等于7，螯合溫度為70℃，螯合時間60min。在最優條件下，螯合率為(63．88 ±0．15)%。

本實驗采用廢棄雞蛋殼這種生物組織為材料與氨基酸直接反應制取氨基酸螯合鈣技術不僅螯合率較高，而且制備過程相對于高溫煅燒、酸溶解法具有節能環保，可有效提高生產效率，生產成本低，市場競爭強等優勢。優化的制備工藝，可用于雞蛋殼資源利用及產業化生產，帶動禽蛋殼綜合利用以及鈣制劑市場的發展。

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