野艾蒿抑菌成分提取工藝的研究

陳海燕，陳曉平

(1．長春科技學院，吉林長春130600;2．吉林農業大學，吉林長春130118)

艾蒿(Artemisia argyi Levl．et Vant)，又稱灸草，為菊科屬多年生草本植物，在全國分布較廣［1］。迄今為止，艾蒿在我國至少有3000多年的應用歷史，如用于制作艾葉酒、艾葉糕點等。

現代研究表明，艾蒿中的化學成分主要集中在莖、葉兩部分，主要有揮發油類、黃酮類、桉葉烷類、三萜類和微量化學元素［2-4］等。艾蒿的活性成分具有抗菌和抗病毒成分，其中主要起抑菌作用的物質有黃酮、揮發油和三萜類［5-7］。艾蒿的水浸液對革蘭氏陽性嗜氣菌具有抗菌作用［8-9］。江茂生［10］等研究了艾蒿提取物對植物病原菌的抑制活性，結果表明艾蒿具有開發為新型植物源農藥的潛力。馬爍等［11-13］以艾蒿中黃酮類物質為研究對象，探索黃酮類物質對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白曲霉的抑制情況。確定了艾蒿中黃酮物質對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制較強，但并沒有給出確切數據。

本研究以大腸桿菌為指示菌，以艾蒿提取物抑菌圈直徑為響應值，對超聲波輔助乙醇提取法的主要工藝參數進行優化以期獲得最佳提取工藝，旨在探索高效提取艾蒿抑制物質的條件。高效提取這些抑菌物質可用于食品中果蔬及其制品的殺菌，也為進一步研發艾蒿功能性食品，保健產品提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

艾蒿(Artemisia argyi L) 雙陽湖水庫;大腸桿菌(Escherichia coli) 長春科技學院食品微生物實驗室;無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮 均為分析純。

微型植物粉碎機 天津泰斯特儀器設備有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精科儀器有限公司;電子天平 上海精科儀器有限公司;旋轉蒸發器 南京科爾儀器設備有限公司;超凈工作臺 天津永利達實驗室設備有限公司;生化培養箱 上海精科儀器有限公司;超聲波發生器 上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 原料預處理 艾蒿在未開花時采收，取新鮮的艾蒿，除去雜質，置于干燥箱中在60℃的條件下烘干，再用粉碎機粉碎，過100目篩制成植物干粉，并置于0℃的低溫下密封保存備用。

1．2．2 艾蒿抑菌成分生物活性的研究 以大腸桿菌為指示菌，用瓊脂孔穴擴散法［14］來評價艾蒿抗菌成分對大腸桿菌的抑菌效果。判定標準［15］:抑菌圈直徑≥10mm者被判為有抑菌作用，抑菌圈直徑 ＜10mm者被判為無抑菌作用，3次重復實驗均有抑菌作用，才可判為實驗結果有效。陰性對照組應無抑菌圈產生，否則實驗無效。

1．2．3 單因素實驗

1．2．3．1 超 聲 功 率 對 艾 蒿 提 取 液 抑 菌 效 果 的 影響 準確稱取10g艾蒿粉，超聲功率分別為100、200、300、400、500W，料液比為 1∶20，超聲時間為20min，乙醇濃度為60%，浸提溫度為60℃，浸提時間為8h，抽濾后將濾液旋轉蒸發后定容至25mL。以大腸桿菌為指示菌［16-18］進行抑菌實驗，記錄抑菌圈直徑大小，實驗重復三次。

1．2．3．2 超 聲 時 間 對 艾 蒿 提 取 液 抑 菌 效 果 的 影響 準確稱取10g艾蒿粉，超聲時間分別為10、20、30、40、50min，料液比為 1∶20，超聲功率為 300W，乙醇濃度為60%，浸提溫度為60℃，浸提時間為8 h，方法同 1．2．3．1。

1．2．3．3 乙 醇 濃 度 對 艾 蒿 提 取 液 抑 菌 效 果 的 影響 準確稱取10g艾蒿粉，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，料液比為 1∶20，超聲功率為300W，超聲時間為20min，浸提溫度為60℃，浸提時間為 8h，方法同 1．2．3．1。

1．2．3．4 乙醇浸提溫度對艾蒿提取液抑菌效果的影響 準確稱取10g艾蒿粉，浸提溫度分別為50、60、70、80、90℃，料液比為1∶20，超聲功率為 300W，超聲時間為20min，乙醇濃度為60%，浸提時間為8h，方法同 1．2．3．1。

1．2．3．5 乙醇浸提時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響 準確稱取10g艾蒿粉，浸提時間分別為2、4、6、8、10h，料液比為1∶20，超聲功率為300W，超聲時間為20min，乙醇濃度為60%，浸提溫度為60℃，方法同1．2．3．1。

1．2．3．6 料液比對艾蒿提取液抑菌效果的影響 準確稱取 10g 艾蒿粉，料液比分別為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，超聲功率為 300W，超聲時間為 20min，乙醇濃度為60%，浸提溫度為60℃，浸提時間為8h，方法同 1．2．3．1。

1．2．4 最佳提取工藝的優選 根據中心組合(Box-Behnken)實驗設計原理，通過四因素三水平的響應面分析方法。通過單因素實驗結果綜合分析，確定料液比為1∶15，乙醇浸提時間6h，從而選取超聲功率(A)、超聲時間(B)、乙醇濃度(C)、浸提溫度(D)作為考察變量，抑菌圈直徑(Y)為響應值，通過Design-Expert 7．0設計軟件進行多元回歸分析。實驗設計因素水平見表1。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2．1．1 超聲功率對艾蒿提取液抑菌效果的影響 超聲功率對艾蒿提取液抑菌效果的影響結果見圖1。

表1 中心組合實驗方案Table 1 Factors and levels of RAS test

圖1 超聲功率對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．1 Effect of ultrasonic power on bacteria inhibiting result

由圖1可知，隨著超聲功率增大，艾蒿抑菌能力先增加后減少，超聲功率為200W時艾蒿抑菌成分浸出最多。隨著超聲功率繼續增加，艾蒿抑菌成分浸出又逐漸減少，導致這種結果原因可能是當超聲功率較大時，部分艾蒿抑菌成分發生分解，從而導致抑菌效果降低。

2．1．2 超聲時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響 超聲時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響結果見圖2。

圖2 超聲時間對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．2 Effect of ultrasonic time on bacteria inhibiting result

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，艾蒿抑菌物質浸出隨之增多。當超聲時間達到30min時艾蒿抑菌物質浸出達到最大值，所以選取超聲時間30min作為響應面水平值。

2．1．3 乙醇濃度對艾蒿提取液抑菌效果的影響 乙醇濃度對艾蒿提取液抑菌效果的影響結果見圖3。

由圖3可知，隨著乙醇濃度增大，抑菌物質浸出隨之增多，當乙醇濃度達到60%時，抑菌物質浸出達到最大值，抑菌效果最好，所以選取乙醇濃度60%左右作為響應面水平值。

2．1．4 浸提溫度對艾蒿提取液抑菌效果的影響 浸提溫度對艾蒿提取液抑菌效果的影響結果見圖4。

圖3 乙醇濃度對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．3 Effect of ethanol concentration on bacteria inhibiting result

圖4 乙醇浸提溫度對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．4 Effect of ethanol extraction temperature on bacteria inhibiting result

由圖4可知，浸提溫度在50～70℃范圍內，隨著溫度升高，抑菌效果隨之增強，當溫度達到70℃時，抑菌效果最好，之后，隨著溫度繼續升高，抑菌效果反而下降，所以選取浸提溫度70℃左右作為響應面水平值。

2．1．5 浸提時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響 浸提時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響結果見圖5。

圖5 乙醇浸提時間對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．5 Effect of ethanol extraction time on bacteria inhibiting result

由圖5可知，隨著時間增長，抑菌效果隨之增強，浸提時間為6h時艾蒿提取物的抑菌效果最好，6h后隨著時間繼續增長，浸提物浸出不明顯，這說明提取時間達到6h時抑菌成分已經充分溶出。因此，綜合考慮在響應面實驗設計中選取浸提時間為6h。

2．1．6 料液比對艾蒿提取液抑菌效果的影響 料液比對艾蒿提取液抑菌效果的影響結果見圖6。

圖6 料液比對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．6 Effect of ratio of liquid material on bacteria inhibiting result

由圖6可知，隨著料液比逐漸增大，艾蒿抑菌效果隨之增強，當料液比為1∶15時，抑菌效果最佳，當料液比繼續增加時，抑菌圈直徑基本沒有增加。在響應面實驗設計中選取料液比為1∶15。

2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗

按照Box-Behnken實驗方案進行四因素三水平實驗，結果見表2。將所得的實驗數據采用響應面Design Expert7．0軟件進行多元回歸擬合，得到以抑菌圈直徑(cm)對超聲功率(W)、超聲時間(min)、乙醇濃度(%)、浸提溫度(℃)的二次多項回歸方程為:Y=2．60+0．27A+0．24B+0．19C+0．18D+0．14AB-0．097AC-0．010AD-5．000 × 10-3BC+0．098BD+0．025CD-0．23A2-0．33B2-0．28C2-0．36D2

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Program and results of RSM test

表3 響應面實驗方差分析Table 3 Variance analysis for the developed regression model

式中:Y-抑菌圈直徑(cm)，A-超聲功率(W)，B-超聲時間(min)，C-乙醇濃度(%)，D-浸提溫度(℃)。

為檢驗方程的有效性，對超聲波提取艾蒿抑菌成分的數學模型進行方差分析，結果如表3所示。

由表3可以看出，一次項回歸模型均達到極顯著水平(p＜0．01)，說明超聲功率、超聲時間、乙醇濃度和浸提溫度對艾蒿抑菌成分提取有極顯著影響，表明回歸方程與實際情況吻合較好，實驗誤差小。所以可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。交互項AB達到極顯著水平(p＜0．01)，說明超聲功率和超聲時間交互項對艾蒿抑菌成分提取有極顯著影響，交互項AC、BD達到顯著水平(p＜0．05)，說明超聲功率和乙醇濃度交互項、超聲時間和浸提溫度對艾蒿抑菌成分提取有顯著影響。二次項A2、B2、C2、D2均達到極顯著水平(p ＜ 0．01)。回歸模型中 A、B、C、D、AB、AC、BD、A2、B2、C2、D2作用顯著。由各變量顯著性檢驗F值的大小，可以得出艾蒿抑菌成分提取的各影響因素按大小依次排序為:超聲功率、超聲時間、乙醇濃度、浸提溫度。

2.3 響應面及等高線分析結果

利用Design Expert7．0軟件，根據回歸方程分析作響應曲面見圖7、圖8、圖9、圖10。

如圖7所示，超聲功率與超聲時間的曲面均較陡，說明超聲功率與超聲時間對抑菌圈直徑的大小有極顯著的影響。等高線趨近于橢圓形，說明超聲功率與超聲時間的交互項對抑菌圈直徑的大小有極顯著的影響。

圖7 超聲功率與超聲時間對艾蒿抑菌物質提取的影響的響應面圖Fig．7 Response surface showing the effects of ultrasonic power and ultrasonic time on the Artemisia argyi antibacterial ingredient

如圖8所示，超聲功率與乙醇濃度的曲面明顯的較陡，呈二次關系，說明超聲功率與乙醇濃度對抑菌圈直徑的大小有極顯著的影響。等高線趨于橢圓形，表示這兩個因素的交互項也對抑菌圈直徑有顯著的影響。

如圖9所示，超聲功率的曲面較陡，呈二次關系，對抑菌圈直徑的大小影響較大，等高線呈圓形說明兩因素的交互項影響不顯著。

圖8 超聲功率與乙醇濃度對艾蒿抑菌物質提取的影響的響應面圖Fig．8 Response surface showing the effects of ultrasonic power and ethanol concentration on the Artemisia argyi antibacterial ingredient

圖9 超聲功率與浸提溫度對艾蒿抑菌物質提取的影響的響應面圖Fig．9 Response surface showing the effects of ultrasonic power and extraction temperature on the Artemisia argyi antibacterial ingredient

如圖10所示，超聲時間與浸提溫度的曲面均較陡，呈二次關系，說明超聲時間與浸提溫度對抑菌圈直徑的大小有顯著的影響。與此同時等高線趨于橢圓形，表示這兩個因素的交互項也對抑菌圈直徑有顯著的影響。

圖10 超聲時間與浸提溫度對艾蒿抑菌物質提取的影響的響應面圖Fig．10 Response surface showing the effects of ultrasonic time and extraction temperature on the Artemisia argyi antibacterial ingredient

2.4 超聲波提取法響應面優化結果

經響應面7．0軟件的數值優化與二次回歸模型的數據分析，本研究提取艾蒿抑菌成分的最佳工藝參數為:超聲時間為 35．62min、超聲功率為 269．74 W、浸提溫度為73．27℃、乙醇濃度為51．18%，大腸桿菌抑菌圈直徑預測值為2．78cm。

2.5 野生艾蒿抑菌成分最佳提取條件的確定和驗證實驗

結合實際操作的數據真實性，并驗證預測結果，在最佳提取工藝條件下:超聲時間35min、超聲功率270W、浸提溫度73℃、乙醇濃度51%重復實驗3次，結果艾蒿提取液抑菌圈直徑為2．62cm。與預測值2．78cm相對誤差為6．11%，說明該分析結果與實際操作結果擬合良好，充分驗證所建模型正確性，說明響應面法適用于對野生艾蒿抗菌物質的超聲提取工藝參數優化及回歸分析。

3 結論

超聲波輔助乙醇提取法的最佳工藝條件為:超聲功率270W、超聲時間35min、乙醇濃度51%、浸提溫度73℃、乙醇浸提時間6h、料液比1∶15，該條件下，獲得的艾蒿抗菌成分抑菌圈直徑為2．62 cm。

［1］周峰，秦路平．艾葉的化學成分、生物活性和植物資源［J］．藥學實踐雜志，2000，18(2):96-98．

［2］顧靜文，劉立鼎．艾蒿和野艾蒿精油的化學成分［J］．江西科學，1998，16(4):273-276．

［3］謝靜華．艾蒿的開發利用前景［J］．寧夏農林科技，2004，5:57-58．

［4］胡林峰，崔乘幸，吳玉博，等．艾蒿化學成分及其生物活性研究進展［J］．河南科技學院學報，2010，38(4):75-78．

［5］孫紅祥．一些中草藥及其揮發性成分抗霉菌活性研究［J］．中國中藥雜志，2001，26(2):99-102．

［6］紀麗蓮，張強華．八種菊科中草藥抗霉菌及飼料霉變的研究［J］．生命科學研究，2003，7(4):350-354．

［7］吳光旭，何庭玉，劉愛媛，等．植物中抗病原真菌的活性物質［J］．植物學通報，2004，21(3):367-375．

［8］OZKAL S G，YENER M E，BAYINDIRLI L．Response surfaces of apricot kernel oil yield in supercritical carbon dioxide［J］．Food Science and Technology，2005，38(6):611-616．

［9］劉軍海，黃寶旭，蔣德超．響應面分析法優化艾葉多糖提取工藝研究［J］．食品科學，2009，30(2):114-118．

［10］李亞娜．林永成．佘志剛．響應面分析法優化羊棲菜多糖的提取工藝［J］．華南理工大學學報:自然科學版，2004，32(11):29-31．

［11］劉洋，趙謀明，楊寧．響應面分析法優化仙人掌多糖提取工藝的研究［J］．食品與機械，2006，22(6):42-45．

［12］沈萍，范秀容．微生物學實驗［M］．第3版．北京高等教育出版社，1996．

［13］楊宇，陳曉平．響應面法優化野生艾蒿中抗菌成分工藝的研究［J］．食品科技，2013，12(5):197-202．

［14］熊子文，羅麗萍，張麗麗．響應面法優化野艾蒿總黃酮的超聲波提取工藝［J］．食品科學，2011，32(8):38-42．

［15］戴喜末，熊子文，羅麗萍．響應面法優化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究［J］．食品科學，2011，32(8):93-97．

［16］羅興武．艾蒿總黃酮的超聲波提取工藝研究［J］．食品研究與開發，2011，12(7):39-44．

［17］馬爍，吳朝霞，張琦，等．艾蒿中總黃酮的提取及抑菌實驗［J］．中國食品添加劑，2011(2):71-78．

［18］江茂生，許文耀．艾蒿提取物對13種植物病原菌物的抑制作用［J］．福建農林大學學報:自然科學版，2007，6(4):352-356．