基于DSPE-LC-MS/MS法的畜禽產品中雌激素的測定

王 剛，孫媛媛，唐曉姝，張秋香，印伯星，房東升，張 灝，陳 衛，2，*

(1．江南大學食品學院，江蘇無錫214122;2．江南大學食品科學與技術國家重點實驗室江蘇無錫214122;3．揚州市揚大康源乳業有限公司，江蘇揚州225004)

環境激素是由于人類的生產及活動而釋放到周圍環境中，能夠影響人類或動物的內分泌、神經和免疫系統等，從而導致其生殖、發育異常甚至惡性腫瘤發生等異常生物學效應的一類環境污染物［1-6］。1996年歐盟首次將環境激素分為5大類，其中類固醇類雌激素是一類生物活性最強的環境激素［7］。雌激素可以分為天然雌激素和人工合成雌激素兩大類:天然雌激素主要來源于人體和哺乳動物，又稱為內源性雌激素，主要包括雌酮(estrone，E1)、雌二醇(estradiol，E2)和雌三醇(estriol，E3)等;人工合成雌激素以己烯雌酚(diethylstibestrol，DES)為代表。雌激素類藥物在畜禽養殖中具有通過蛋白質同化作用提高食欲的功效，曾被用來提高飼料轉化率，促進動物生長。但由于人工合成雌激素具有致癌作用，美國和加拿大已限量使用，而歐盟則禁止使用［8-9］。我國也于2002年發布《中華人民共和國農業部公告第235號》，明確將DES及其鹽列為禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出［10］。然而現階段雌激素在動物養殖過程中濫用的情況時有發生，畜禽類產品中的雌激素殘留已經成為一個日益嚴重的食品安全問題。因此，對畜禽產品中雌激素的含量進行檢測很有必要。

雌激素檢測的傳統方法通常有免疫法［11］、液相色譜串聯質譜法［12］、氣相色譜串聯質譜法［13］等。本實驗室曾建立了用分散固相萃取方法(DSPE)前處理、液相色譜串聯四級桿質譜(LC-MS/MS)測定牛奶及酸奶中雌激素含量的檢測方法(DSPE-LC-MS/MS)［14］。本研究在此基礎上，進一步使用該方法對部分畜禽產品中4種雌激素的殘留進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌酮(E1)、雌二醇(E2，96．7%)、雌三醇(E3，97．4%)、己烯雌酚(DES，99．9%) 中國藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇、醋酸(色譜純)Tedia公司;分析純無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、氯化鈉，弗羅里硅土(Florisil，60-100 目)，中性氧化鋁(Alumina-N，100-200目):國藥集團;N-丙基乙二胺(PSA)Agilent公司;雞肉、牛肉、豬肉、雞肝及雞蛋等 當地市場。

超高效液相-串聯四級桿質譜儀(UPLC-TQD)及 ACQUITY BEH C18柱(1．7μm，100mm × 2．1mm)美國Waters公司;超聲儀(SB4200DT) 寧波新芝生物技術;電子天平 EL3002(d=0．01g)、分析天平AB103-N(d=0．0001g) 瑞士Mettler Toledo公司;超速離心機(D-78532) 德國Hettich公司;小型高速離心機(5415R) 德國Eppendorf公司;九陽攪拌機(JYL-C020) 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

標準溶液配制:分別精確稱取 E1、E2、E3、DES各2mg置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成終濃度為400mg/L的單標儲備液，-20℃保存;為達到快速檢測的目的，將4種單標儲備液按一定比例混合配成混合標準液，以繪制標準曲線。由于質譜儀對4種雌激素的響應值不同，通過調整將單標儲備液按比例 E1∶E2∶E3∶DES=2∶8∶8∶1 混合，以保證4種雌激素的峰面積在同一數量級上。

樣品制備:稱取剔除骨、皮的動物肌肉組織及內臟樣本200g，用家用攪拌器進行攪拌粉碎，-20℃密封保存;雞蛋只需于實驗前去蛋殼，將蛋清與蛋黃打碎攪勻。向攪碎的畜禽產品中添加不同濃度的混合標準液(每種濃度做6組平行)，充分攪拌均勻后超聲5min;取4．00g樣品置于50mL聚丙烯離心管中，加入8mL乙腈，渦旋振蕩5min后并于室溫下超聲20min 以充分萃取;加入 0．05g NaCl和 1．60g 無水MgSO4，渦旋振蕩1min，8000r/min、4℃離心10min;取1mL上清至1．5mL離心管中，加入80mg PSA，渦旋振蕩 1min，6000r/min、4℃離心 6min，上清液經 0．22μm微孔濾膜過濾，濾液用LC-MS/MS測定。

液相色譜條件［14］:色譜柱:ACQUITY BEH C18(1．7μm，100mm × 2．1mm);流動相:1% 醋酸銨溶液(A)和甲醇(B);采用梯度洗脫程序:0～0．3min，90%A，10%B(保持 0．2min);0．5～2min，10%A，90%B;2～3min，0% A，100% B(保 持 2min);流 速:0．3mL/min;進樣體積:2μL。

質譜條件［14］:電離方式:ESI-;霧化器壓力:310．3kPa;離子噴霧電壓:4000V;干燥器(N2)流速:650L/min;柱溫:40℃;離子源溫度:120℃;檢測以多反應監測(MRM)方式掃描;4種雌激素經優化后的質譜分析參數見表1。

表1 4種雌激素質譜分析參數Table 1 MS/MS parameters of 4 estrogens

數據處理:作圖及實驗數據統計、分析均使用Microsoft office Excel 2013。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

萃取劑與其用量對回收率的影響:同處理牛奶及酸奶樣品結果相似［14］，當分別使用乙腈和甲醇以沉淀畜禽產品中的蛋白質并萃取雌激素時，甲醇處理后的樣品離心分層效果不明顯，上清液較渾濁;而乙腈萃取的樣品分層效果明顯，上清液清澈。因此本實驗的萃取溶劑仍選擇乙腈。經調整，當使用8mL乙腈處理4．0g畜禽樣品時，萃取液可達澄清且足夠檢測。

吸水劑及其用量對回收率的影響:本研究發現在雞肉中以無水MgSO4作為吸水劑時，4種雌激素的回收率要明顯高于使用相同量的無水Na2SO4作為吸水劑(結果未顯示)。因此選擇無水MgSO4作為樣品制備時的吸水劑并進一步對雞肉樣品中無水MgSO4的最適加入量進行了研究。如圖1所示，在4．0 g雞肉樣品中加入0．05g NaCl及不同量的無水MgSO4，分別檢測其回收率。結果顯示當加入 1．60g無水MgSO4時，4種雌激素的回收率最高，隨著無水MgSO4含量的增加，回收率幾乎保持不變或稍稍有所下降。因此在本研究中每4．00g畜禽產品中無水MgSO4的添加量定為 1．60g。

圖1 添加無水MgSO4對回收率的影響Fig．1 Effect of MgSO4amount on the recovery of 4 estrogens

固相分散吸附劑對回收率的影響:本研究分別以PSA、Florisil和Alumina-N作為固相分散吸附劑檢測了其對雞肉中雌激素回收率的影響。同牛奶中的情況一致，PSA處理過的樣品明顯澄清于用Florisil和Alumina-N處理的樣品(結果未顯示)。因此，選擇PSA作為分散固相吸附劑。

2.2 流動相選擇及質譜條件優化

由于檢測的雌激素相同，本研究沿用了在檢測牛奶及酸奶中雌激素的流動相參數以及質譜條件［14］。流動相具體參數為:體積分數為1%的醋酸銨水溶液和甲醇溶液。

2.3 基質效應

為了評估畜禽產品基質對雌激素檢測的影響，本實驗在質譜分析中比較了加標雞肝、雞肉、牛肉及雞蛋等樣品的響應值(a)與加標純水的響應值(b)的比率(a/b×100，%)。當該比值等于100%時，說明待測物無基質效應;如果比值小于100%，說明基質對待測物的離子響應產生了抑制作用;若比值大于100%，則說明基質的存在增強了待測物的離子響應強度［15］。由表 2可見，4種雌激素的響應比率為90．16%～99．01%，均在 90%以上。畜禽產品基質對4種雌激素的離子響應均只產生了微弱的抑制作用［15］。

表2 4種雌激素在不同樣品中的基質效應Table 2 Matrix effects of animal products on 4 estrogens

2.4 線性范圍、標準曲線和檢出限

以雌激素的質量濃度為X(μg/L)，以目標組分的峰面積為Y(S)作標準曲線，得到4種雌激素對應的線性方程及相關系數。如表3所示，各校準曲線相關系數的平方值(R2)均大于0．99，4種雌激素的質量濃度在8～1500μg/L具有良好的線性關系。以信噪比為3(S/N=3)時，最低檢出限(LOD)可達到0．66μg/L，根據樣品處理方式(樣品∶乙腈 =1∶2)折算至畜禽產品各雌激素最低檢出限為:LOD(E1)=8．06μg/kg，LOD(E2)=16．52μg/kg，LOD(E3)=5．86μg/kg，LOD(DES)=1．32μg/kg。

表3 4種雌激素的線性方程、相關系數、檢出限和線性范圍Table 3 Regression equation，correlation coefficient(R2)，detection limits and linear range of 4 estrogens

2.5 回收率與精密度

在雞肝、雞肉和牛肉樣品中分別添加3個濃度水平的4種雌激素混合標準液，每個添加濃度重復測定6次，計算添加回收率和測定結果的相對標準偏差(表4)。雞肝中4種雌激素的回收率為75．00%～79．13% ，相對標準偏差為 0．47% ～8．82%;雞肉中 4種雌激素的回收率為77．40%～81．28%，相對標準偏差為0．42%～6．57%;牛肉中4種雌激素的回收率為75．25% ～80．61% ，相對標準偏差為 0．24% ～6．25%;雞蛋中4種雌激素的回收率為92．36%～96．63%，相對標準偏差為0．21%～2．06%。采用本方法檢測，雌激素在禽蛋中的回收率最高可達96．63%，而在基質更為復雜的畜禽肉類中雌激素的回收率也均在75%以上，參照畜肉產品中其他物質的檢測［16-18］，本方法基本能夠滿足畜禽產品中E1、E2、E3、DES檢測的要求。

2.6 實際樣品檢測

取不同批次和種類的畜禽產品(每種樣品樣本數≥5)，按照實驗方法1．2中“樣品制備”進行樣品前處理操作(不添加混合標準液)，運用LC-MS/MS進行分析，計算各樣品中4種雌激素殘留量的平均值，結果見表5。從表格中可以看到:E1在各樣品中均無檢出，雞蛋和豬肉中檢測出微量的E2和E3，在所有樣品中均未檢出人工合成雌激素DES。天然雌激素主要來源于卵巢的卵泡顆粒細胞和卵泡內膜細胞。在動物體內，E2活性最強、含量最多，在體內代謝后轉化為E1和 E3，一般動物肌肉中的平均自然濃度約為10ng/g［19］。本實驗所收集樣品中檢測到的E2，E3含量均在天然濃度范圍內，且未檢測到人工合成雌激素DES，可以排除飼養過程中人為添加雌激素的情況。

表4 4種雌激素在雞肝、雞肉、牛肉和雞蛋中的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSD of 4 estrogens in chicken liver，chicken，beef and egg(n=6)

表5 樣品中4種雌激素含量測定Table 5 4 estrogens content in the animal products on market

3 結論

本研究利用實驗室建立的在牛奶及酸奶中檢測雌激素含量的DSPE-LC-MS/MS分析方法對畜禽產品包括雞肉、雞肝、雞蛋、牛肉及豬肉中的4種雌激素進行了檢測，取得了較為滿意的結果。該檢測手段采用DSPE前處理方法，操作簡便、無需特殊設備，對于畜禽產品中雌激素的提取凈化效果較好，回收率較高，所得樣品經液相色譜質譜聯用檢測靈敏度高、無明顯基質效應。該方法可用于畜禽產品中E1、E2、E3以及DES等雌激素的殘留檢測。

［1］Martin O V，Lester J N，Voulvoulis N，et al．Human Health and Endocrine Disruption:A Simple Multicriteria Framework for the Qualitative Assessment of End Point-Specific Risks in a Context of Scientific Uncertainty［J］．Toxicological Sciences，2007，98(2):332-347．

［2］Boyle E，Mmsonneuve E，Autier P．Update on cancer control in women［J］．InternationalJoumal of Gynecology，2000，70(2):263-303．

［3］Carlsen E，Giwercman A，Keiding N，et al．Evidence for decreasing qualities of semen during past 50 years［J］．British Medical Journal，1992，305:609-613．

［4］徐兩蒲，劉暉，王子敬．性早熟女童性激素水平測定分析［J］．福建醫藥雜志，2006，28(4):66-67．

［5］林奕芝，司徒潮滿，劉奮，等．GC-MS法測定肉中雌激素殘留量方法的研究［J］．中國衛生檢驗雜志，2007，17(7):1165-1167．

［6］王玉飛，周凱，摯繼革．GC-MS-MS法同時測定海產品中4 種雌激素殘留［J］．中國衛生檢驗雜志，2006，16(1):21-23．

［7］Norgil Damgaard，Main KM，Toppari J，et al．Impact of exposure to endocrine disrupters in utero and in childhood on adult reproduction［J］．Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2002，16(2):289-309．

［8］Lopez de Alda M J，Barcelo D．Determination of steroid sex hormones and related synthetic compounds considered as endocrine disrupters in water by liquid chromatography-diode array detection mass spectrometry［J］．Journal of Chromatography A，2000，892(1-2):391-406．

［9］李凱年，姜荃．國外對食品藥物殘留控制的發展趨勢［J］．世界農業，2003(5):44-46．

［10］中華人民共和國農業部，動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］．農業部公告第235 號，2002．12

［11］孫俐，鄭文杰，唐丹舟．S/N1956-2007肉及肉制品中己烯雌酚殘留量的檢測方法-酶聯免疫法［S］．北京:中國標準出版社，2007．

［12］張翠英，李振國，徐金玲．LC-MS測定豬肉中己烯雌酚方法的研究［J］．中國衛生檢驗雜志，2007，17(5):786-787．

［13］ZHOU Yi-qi，WANGZi-jian，JIA Ning．Formation of multiple trimethylsilyl derivatives in the derivatization of 17αethinylestradiolwith BSTFA or MSTFA followed by gas chromatography- mass spectrometry determination［J］ ．Environmental Sciences，2000，19:879-884．

［14］唐曉姝，張秋香，杜先鋒，等．DSPE-LC-MS/MS法測定牛奶及酸奶中雌激素［J］．食品工業科技，2013，34(6):53-56．

［15］Salvador A，Moretton C，Piram A．On-line solid-phase extraction with on-support derivatization for high-sensitivity liquid chromatography tandem mass spectrometry of estrogens in influent/effluent of wastewater treatment plants［J］．Journal of Chromatography，2007，1145:102-109．

［16］梁利妹，胡深，董文婷，等．反相高效液相色譜法對畜產品中三聚氰胺殘留的檢測［J］．湖北畜牧獸醫，2013，34(6):11-14．

［17］曹火仁，孫文梅，彭笑蓉，等．高效液相法測定畜產品中磺胺類藥物殘留量的研究［J］．四川畜牧獸醫，2008(6):23-24．

［18］劉祥國，黃顯會，盧陽雯，等．羊肉中8種有機磷農藥殘留的測定及基質效應［J］．中國農業科學，2009，42(4):1478-1484．

［19］Lee HB，Peart TE．Determination of 4-nonylphenol in effluent and sludge from sewage treatment plants［J］．Analytical chemistry，1995，67(13):1976-1980．