三種食源性致病菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物譜快速檢測研究

操慶國，郭 欽 ，劉 涵，徐海棠，李東成

(1．江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，江蘇句容 212000;2．江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物(MVOCs)是一類親脂、低分子量(一般100～300u)、常溫常壓下易揮發(fā)的含碳化合物，其包含很多微生物有用的生物信息［1-2］。MVOCs譜具有種屬特異性，多數(shù)由濃度不等的混合物組成，是微生物特定生理代謝活動(dòng)途徑的后果。特定的細(xì)菌產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物，如胺、氨氣、吲哚、酯類和醇類等。MVOCs可以促進(jìn)或抑制特定植物的生長、調(diào)節(jié)細(xì)菌和真菌種間和種內(nèi)的相互作用、防止昆蟲蟲害，也可以作為檢測特定細(xì)菌的方法之一、或作為檢測人體疾病、食品腐敗或房屋中霉菌生長的標(biāo)記物［3-4］。某些MVOCs如高級(jí)醇類還可以作為生物柴油被利用。目前，已經(jīng)建立的 MVOCs數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics．charite．de/mvoc)已收集 349 種細(xì)菌和69種真菌近1000種代謝產(chǎn)物，并闡明了其結(jié)構(gòu)和代謝途徑。

副溶血弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是重要的食源性致病菌，每年引起多起食品中毒事件，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失和人員傷害。已經(jīng)開發(fā)了多種檢測方法，如傳統(tǒng)的生化檢驗(yàn)、PCR和多重PCR、熒光定量PCR、ELISA快速檢測試劑盒和LAMP等，但這些方法都存在不足之處，如檢測時(shí)間長、成本過高、操作步驟復(fù)雜和假陽性高等，因此建立一種快速、簡便、無損的副溶血弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌檢測方法已迫在眉睫。當(dāng)副溶血弧菌等細(xì)菌污染食物后，其在食物中早期生長時(shí)會(huì)散發(fā)出獨(dú)特的 MVOCs，這些成分會(huì)在空氣中擴(kuò)散，因此對(duì)MVOCs的檢測要早于后期細(xì)菌的可視見生長，有助于防止食物的進(jìn)一步腐敗，預(yù)防食物中毒。由于在細(xì)菌毒素合成之時(shí)，也會(huì)有對(duì)應(yīng)的MVOCs散發(fā)，因此MVOCs的檢測還可以判斷食物中是否有食源性致病菌毒素的產(chǎn)生［5］。

本文主要通過SPME-GC-MS(固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用)聯(lián)用，對(duì)以上三種食源性致病菌進(jìn)行MVOCs譜的檢測，研究其變化規(guī)律，找到其在各個(gè)生長時(shí)期的特征性揮發(fā)性代謝產(chǎn)物成分，從而為三種食源性致病菌的快速檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

致病性副溶血弧菌(tdh+)VP-62和VP-73菌株 鎮(zhèn)江市疾控中心;大腸桿菌1．02389和金黃色葡萄球菌金黃亞種1．02465 中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)。TCBS培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;無水乙醇、氯化鈉等其他化學(xué)試劑 華東國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電子天平 上海精科天平儀器廠;3110-P1000型移液槍 德國Eppendorf公司;全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 鳥取三洋電機(jī)(廣州)有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;GC-MS(氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀) 美國安捷倫科技有限公司;固相微萃取裝置 美國安捷倫科技有限公司;手動(dòng)SPME進(jìn)樣器 上海安普儀器有限公司;XH-C旋渦混合器江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 副溶血弧菌的培養(yǎng)和純化 從25℃保存的TSI斜面培養(yǎng)基挑取菌體，反復(fù)劃線于TCBS平皿上，37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，挑取綠色單菌落進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1．3．2 副溶血弧菌的定時(shí)取樣 從TSI斜面培養(yǎng)基上挑取菌體，轉(zhuǎn)接到BHI液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18～24h。從活化后的液體培養(yǎng)基中吸取200μL菌液分別接種于裝有5mL BHI液體培養(yǎng)基的15mL頂空瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)，于0、8、18、30、42、54h 定時(shí)取樣，進(jìn)行SPME-GC-MS檢測。

1．3．3 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)和純化從4℃保存的LB斜面培養(yǎng)基中挑取菌體，反復(fù)劃線于LB平板上，37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，挑取單菌落進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1．3．4 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的定時(shí)取樣 挑取純化好的單菌落，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)10～12h。從活化后的液體培養(yǎng)基中吸取200μL的菌液分別接種于裝有5mL LB液體培養(yǎng)基的15mL 的頂空瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)，于 0、4、8、12、16、20、24h 定時(shí)取樣，進(jìn)行 SPME-GC-MS 檢測。

1．3．5 固相微萃取條件 用老化時(shí)間和老化溫度65μm萃取頭(Supelco)進(jìn)行萃取。在加有5mL發(fā)酵液的15mL頂空瓶中插入萃取頭，37℃預(yù)熱5min，萃取吸附30min，GC解吸5min(250℃)，用于 GC-MS分析。

1．3．6 GC-MS分析條件 色譜柱為 AB-1701毛細(xì)管柱(30m ×0．25mm，i．d．× 0．25μm);升溫程序:45℃保持4min，以8℃/min的速度升溫至220℃，保持5min;載氣 He 流速 1．0mL/min，進(jìn)樣量 1μL，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量為70eV;離子源溫度為 230℃;質(zhì)量掃描范圍 m/z 35～500。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取頭的選擇

SPME有多種萃取頭，非極性的100μm PDMS纖維頭對(duì)非極性、弱極性或親脂性組分靈敏度較高;弱極性的65μm PDMS/DVB纖維頭對(duì)極性和非極性組分都有較好的吸附能力;75μm CAR/PDMS纖維頭對(duì)于揮發(fā)性較強(qiáng)的如氣體硫化物有很好的吸附能力。分別用這三種萃取頭，對(duì)VP-62 54h培養(yǎng)物進(jìn)行了SPME-GC-MS的測定，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，65μm PDMS/DVB纖維頭出峰數(shù)和可檢出化合物數(shù)較多，對(duì)于極性、非極性和弱極性的揮發(fā)性化合物都具有很強(qiáng)的吸附能力。因此選擇65μm PDMS/DVB纖維頭進(jìn)行三種食源性致病菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物譜的測定。

2.2 萃取條件優(yōu)化

SPME分析結(jié)果除與纖維頭本身的性質(zhì)相關(guān)外，還與萃取時(shí)間、萃取溫度、萃取頭浸入深度等相關(guān)。

由于人體溫度接近37℃，細(xì)菌的最適培養(yǎng)溫度為37℃，因此選擇37℃作為萃取溫度;以VP-62 54h培養(yǎng)物為樣品，選用65μm PDMS/DVB萃取纖維頭，比較不同萃取時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響，結(jié)果如表2。

如表2所示，隨著萃取時(shí)間的延長，出峰數(shù)不斷增加，但當(dāng)萃取時(shí)間超過30min后，出峰數(shù)雖然繼續(xù)增加，但相差不大。萃取時(shí)間過長會(huì)使SPME纖維頭帶上大量水分，從而影響GC-MS的檢測效果，因此選擇30min作為萃取時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同萃取時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響Table 2 The effects of different extraction time on the extraction results

2.3 微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物譜(MVOCs)分析

2．3．1 副溶血弧菌MVOCs譜分析 對(duì)2株副溶血弧菌和BHI空白培養(yǎng)基進(jìn)行萃取，GC-MS檢測發(fā)酵液中MVOCs成分，分析副溶血弧菌揮MVOCs的變化趨勢，結(jié)果如圖1所示。VP-62和VP-73在不同時(shí)間段MVOCs出峰數(shù)不同，隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸增加，均在30h時(shí)達(dá)到最大值，分別有41和37個(gè)峰，其后VP-62的出峰數(shù)迅速下降，而VP-73的出峰數(shù)在42h后又迅速上升。

圖1 副溶血弧菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物變化趨勢Fig．1 The trends of volatile metabolites of Vibrio parahaemolyticus VP-62 and VP-73

對(duì)副溶血弧菌的MVOCs譜進(jìn)行分析(表3)，發(fā)現(xiàn)八甲基環(huán)四硅氧烷、十甲基環(huán)戊硅氧烷和六甲基環(huán)三硅氧烷含量較高，但這三種屬于柱流失成分，應(yīng)該與細(xì)菌代謝無關(guān)。除此之外，BHI空白培養(yǎng)基MVOCs能檢出19種物質(zhì)，其主要成分為(3-甲氧基-苯基)-(6-甲基-4-苯基喹唑啉-2-基)-胺、2，5-雙(1，1-二甲基乙基)-苯酚和4-甲基-2-三甲基甲硅烷氧基-三甲基甲硅烷基酯苯甲酸。培養(yǎng)30h的VP-62和VP-73 MVOCs譜略有差異，可檢出化合物分別為28和31個(gè)，包括烷、酸、醇、醚和肟等多種中間代謝產(chǎn)物和有機(jī)物。兩者M(jìn)VOCs譜都產(chǎn)生了相同的主要特征成分2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶、二叔丁基過氧化氫、3-甲基-1-丁醇等，而BHI培養(yǎng)基則缺乏這些成分，表明它們是由副溶血弧菌代謝過程中獨(dú)特產(chǎn)生。副溶血弧菌一般都分泌胞外蛋白酶和脂肪酶，喜歡污染肉類食品，BHI培養(yǎng)基的主要成分為牛腦、牛心浸出物、蛋白胨和葡萄糖，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量較高，因此其可以把培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)和氨基酸分解成含硫和胺類化合物，脂肪則被氧化成過氧化物，進(jìn)而分解為醛、酮等，糖類等則被分解成酸、醇等［6］。烷烴類的物質(zhì)可能是脂肪降解和氧化的次級(jí)產(chǎn)物。這些成分混合在一起賦予副溶血弧菌發(fā)酵產(chǎn)物不愉快的腐敗臭味，也具有一定的毒性。如2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶是一種化學(xué)防腐劑“果立鮮”的主要成分，二叔丁基過氧化氫和3-甲基-1-丁醇對(duì)粘膜及腸道有刺激作用，可引起灼燒感、頭痛、惡心及嘔吐等過敏反應(yīng)，對(duì)該菌引起的胃腸道炎癥有一定貢獻(xiàn)。

圖2 副溶血弧菌VP-62和VP-73培養(yǎng)12h發(fā)酵液總離子流色譜圖Fig．2 The total ion chromatograms of V．parahaemolyticus VP-62(a)and VP-73(b)after 12h culture

2．3．2 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測

2．3．2．1 大腸桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測 對(duì)大腸桿菌1．02389發(fā)酵產(chǎn)物和LB空白培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性萃取，用GC-MS對(duì)發(fā)酵液中MVOCs進(jìn)行檢測，分析大腸桿菌MVOCs的變化規(guī)律，結(jié)果如圖3所示。LB空白培養(yǎng)基經(jīng)GC-MS分析后共檢測到51個(gè)峰，可檢出化合物為44個(gè)。大腸桿菌1．02389不同培養(yǎng)時(shí)間出峰數(shù)略有不同，隨時(shí)間的增加，出峰數(shù)先下降再升高，12h時(shí)達(dá)到最大值，有55個(gè)峰，可檢出化合物為42個(gè)，其后出峰數(shù)迅速下降，16h后保持穩(wěn)定。大腸桿菌MVOCs出峰數(shù)的變化可能跟其生長時(shí)期相關(guān)，對(duì)數(shù)期出峰較多，變化較大，穩(wěn)定期后出峰數(shù)下降且

維持恒定。

表3 副溶血弧菌MVOCs譜Table 3 The MVOCs spectrum of V．parahaemolyticus

圖3 大腸桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物變化規(guī)律Fig．3 The changes of volatile metabolites of E．coli

圖4 空白LB培養(yǎng)基總離子流色譜圖Fig．4 The total ion chromatograms of control

圖5 大腸桿菌1．02389培養(yǎng)12h總離子流色譜圖Fig．5 The total ion chromatograms of E．coli after 12h culture

大腸桿菌培養(yǎng)12h的MVOCs成分如表4，峰圖見圖5。從表4中看出，除掉柱流失成分外，LB空白培養(yǎng)基中主要成分為2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶和2，4-雙(1，1-二甲基乙基)苯酚等酮類、苯酚類成分;而培養(yǎng)12h的大腸桿菌發(fā)酵液中MVOCs譜主要成分為烷類、烴類、雜環(huán)類和醇類化合物，其生長代謝產(chǎn)生了區(qū)別于LB的特征性揮發(fā)性物質(zhì)，如硫代乙酸S-［8-(二乙基膦酰基)辛基］酯、1，3-二苯基-1-(三甲基甲硅烷氧基)-1-庚烯、環(huán)十二烷、2-甲基-1-丁醇和八溴癸等，這些物質(zhì)都屬于化學(xué)中間體，對(duì)皮膚和粘膜都具有刺激作用，可引起眩暈、嘔吐及紫紺等反應(yīng)。

2．3．2．2 金黃色葡萄球菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測 用SPME-GC-MS檢測金黃色葡萄球菌發(fā)酵液MVOCs變化規(guī)律，結(jié)果如圖6所示。隨培養(yǎng)時(shí)間增加，金黃色葡萄球菌出峰數(shù)迅速下降，之后快速上升，8h達(dá)到最大值，有60個(gè)峰，可檢出化合物為47個(gè)，其后出峰數(shù)慢慢下降，16h后保持穩(wěn)定。MVOCs出峰數(shù)的變化可能跟其生長周期相關(guān)，對(duì)數(shù)期最高，穩(wěn)定期后出峰數(shù)保持恒定。

金黃色葡萄球菌MVOCs譜成分較多(表4)，培養(yǎng)8h產(chǎn)生的區(qū)別于LB培養(yǎng)基的特征性揮發(fā)性成分為吲嗪、3-甲基丁酸和4-甲氧基芐腈。其中，吲嗪又稱為中氮茚，是吲哚的異構(gòu)體之一，具有強(qiáng)烈臭味，其衍生物在生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。研究結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌的生長代謝產(chǎn)生了特征性的揮發(fā)性物質(zhì)。

圖6 金黃色葡萄球菌1．02465揮發(fā)性代謝產(chǎn)物變化規(guī)律Fig．6 The changes of volatile metabolites of Staphylococcus aureus

圖7 金黃色葡萄球菌1．02465培養(yǎng)12h總離子流色譜圖Fig．7 The total ion chromatograms of S．Aureus after 12h culture

3 結(jié)論

目前，SPMEGC-MS作為一種快速檢測手段，已應(yīng)用于食品風(fēng)味和有害成分分析、食品微量元素檢測、食品中農(nóng)藥和有機(jī)物殘留及微生物MVOCs的快速定性、定量測定［7］。

不同微生物MVOCs譜區(qū)別較大，如鏈霉菌屬和黃色粘球菌可分別產(chǎn)生26和42種揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，本研究中兩株副溶血弧菌MVOCs在30h有28和31種成分，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌則分別為42和47種。隨培養(yǎng)時(shí)間延長，微生物MVOCs譜逐漸變化［8］，研究表明，這三種致病菌一般在對(duì)數(shù)期時(shí)MVOCs譜成分能達(dá)到最大值，穩(wěn)定期后逐漸保持恒定，這可能是因?yàn)閷?duì)數(shù)期細(xì)菌生長活躍、新陳代謝旺盛，所以產(chǎn)生的特征性代謝產(chǎn)物較多，因此當(dāng)這三種致病菌污染食物時(shí)，應(yīng)盡量在早期進(jìn)行MVOCs譜測定。

續(xù)表

續(xù)表

每一個(gè)細(xì)菌都有其獨(dú)特的MVOCs成分，如丙酮丁醇梭菌為丁酸和丙酮，嗜酸耐熱菌的主要代謝產(chǎn)物為愈創(chuàng)木酚和2，6-二溴苯酚等［9］，這些特征性成分可以檢測該種細(xì)菌的生長和污染狀況的標(biāo)記物，從而建立細(xì)菌快速檢測平臺(tái)。如煙酸甲酯可以作為檢測和診斷結(jié)核分枝桿菌的非侵入性方法，2-壬酮可以在體外作為檢測銅綠假單胞菌感染肺炎的標(biāo)記物［4］，葡萄穗霉在任何培養(yǎng)基上都會(huì)產(chǎn)生苯甲醚作為特征性成分［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶、二叔丁基過氧化氫、3-甲基-1-丁醇等也許可以作為判斷副溶血弧菌生長的標(biāo)記物，環(huán)十二烷和吲嗪等也許能作為判斷大腸桿菌和金黃色葡萄球菌污染肉類食品的標(biāo)記物，但這還需要進(jìn)一步的研究和比對(duì)。

運(yùn)用GC-MS-SPME檢測致病菌的特征性MVOCs，可建立肉制品和水產(chǎn)品的在線安全檢測平臺(tái)，具有無損、快速、樣品用量低等優(yōu)點(diǎn)，并能在早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)牛肉、雞肉等的污染程度，避免食物中毒，挽回經(jīng)濟(jì)損失，因此具有較好的發(fā)展前景［10］。

［1］Zhang ZM Zhang，Li GK．A Review of Advances and New Developments in the Analysis of Biological Volatile Organic Compounds［J］．Microchemical Journal，2010，95:127-139．

［2］Hock B．The Mycota(IX):Fungal Associations［M］．Berlin，Heidelberg:Springer-Verlag Berlin and Heidelberg GmbH＆Co．K，2000．

［3］Kai M，Haustein M，Molina F，et al．Piechulla Bacterial Volatiles and TheirAction Potential［J］．ApplMicrobiol Biotechnol，2009，81:1001-1012．

［4］Betancourt DA，Krebs K，Moore SA，et al．Microbial Volatile Organic Compound Emissions from Stachybotrys ChartarumGrowing on Gypsum Wallboard and Ceiling tile［J］．BMC Microbiology，2013，13:283-289．

［5］許傳坤，莫明和，張克勤．固相微萃取-氣質(zhì)法測定土壤揮發(fā)性抑菌物質(zhì)［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2004，31(5):14-19．

［6］楊康，岳田利，袁亞宏，等．利用頂空SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測蘋果汁中嗜酸耐熱菌代謝產(chǎn)物的研究［J］．農(nóng)產(chǎn)品加工，2007，94(3):8-12．

［7］梁華正，張燮，饒軍，等．微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生途徑及其質(zhì)譜檢測技術(shù)［J］．中國生物工程雜志，2008，28(1):124-33．

［8］金偉平，黃志強(qiáng)，劉群群．頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析單增李斯特菌污染冷藏牛肉的揮發(fā)性物質(zhì)［J］．食品科學(xué)，2012，33(2):243-248．

［9］Lemfack MC，Nickel J，Dunkel M，et al．mVOC:a Database of Microbial Volatiles［J］．Nucleic Acids Research，2014(42):744-748．

［10］李雅萍，賀麗蘋，陳玉芬，等．SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)分析蜂膠中揮發(fā)性成分的研究［J］．現(xiàn)代食品科技，2007，23(7):78-80．