復(fù)發(fā)性口腔潰瘍大鼠模型免疫功能與血清因子的變化分析＊

西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系口腔修復(fù)正畸學(xué)教研室 （西安710021）

周 芳 李 東▲ 王丹楊△ 郭 娜＃ 王 琳＃ 左艷萍

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是臨床上常見(jiàn)的口腔黏膜病。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的誘因主要為局部創(chuàng)傷、精神緊張、食物、藥物、激素水平改變等，而感染因素、系統(tǒng)性疾病因素及環(huán)境因素等對(duì)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展起到重要作用［1，2］。對(duì)于免疫因素來(lái)說(shuō)，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者存在細(xì)胞免疫功能下降和T淋巴細(xì)胞亞群失衡，表明人類(lèi)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生與自身免疫相關(guān)［3］。血清因子是影響患者機(jī)體狀況的重要因素，其中血清氧自由基在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍活動(dòng)期及恢復(fù)期的發(fā)生中有重要作用。但這些細(xì)胞因子及免疫系統(tǒng)在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍中的作用及機(jī)制目前尚處在探索階段。本文為此通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析了復(fù)發(fā)性口腔潰瘍大鼠模型免疫功能與血清因子的變化，希望為分析復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制提供參考。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 SD清潔級(jí)大鼠60只，雄性30只，雌性30只，體重180～200g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPX）和丙二醛（MDA）等試劑盒來(lái)自南京建成生物工程研究所，完全費(fèi)氏佐劑來(lái)自美國(guó)Sigma公司，生理鹽水、PBS緩沖液、蒸餾水、無(wú)水乙醇、二甲苯等來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室；兔抗鼠CD4單克隆抗體和兔抗鼠CD8單克隆抗體來(lái)自美國(guó)Beckman Coulter公司；左旋咪唑來(lái)自武漢合中化工制造有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 高速離心機(jī)由北京京立離心機(jī)有限公司生產(chǎn)、組織勻漿器由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司、可見(jiàn)光分光光度計(jì)購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司、生物組織石蠟切片機(jī)購(gòu)自沈陽(yáng)譽(yù)德電子儀器有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3．1 動(dòng)物分組：將60只SD清潔級(jí)大鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、模型組及左旋咪唑組3組，每組20只，雌雄平分，體重也為180～200g。所有大鼠同室分籠飼養(yǎng)，嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的要求進(jìn)行操作，飼養(yǎng)1周適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3．2 動(dòng)物造模：將大鼠麻醉后剝?nèi)】谇火つぃ尤?．1mol／L，pH7．4的PBS緩沖液制成組織勻漿。免疫動(dòng)物時(shí)，將組織勻漿與弗氏佐劑等比例混合，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作制成抗原乳化劑。將模型組和左旋咪唑組的大鼠脊柱兩側(cè)剪去鼠毛，碘伏消毒后每側(cè)皮下注射0．1ml抗原乳化劑，每周注射1次，注射周期為3次。觀察大鼠口腔黏膜變化，沒(méi)有注射抗原大鼠為正常對(duì)照組。經(jīng)過(guò)觀察，在第3次注射抗原乳化液1周后所有大鼠模型均出現(xiàn)口腔潰瘍，而正常對(duì)照組大鼠的口腔則未有明顯的變化。同時(shí)手術(shù)刀片切取模型組口腔潰瘍黏膜組織及正常對(duì)照組大鼠的口腔黏膜組織，進(jìn)行病理觀察。

3．3 給藥方法：在口腔潰瘍模型制作完成后進(jìn)行給藥，正常對(duì)照組及模型組大鼠均給予正常飲食水，左旋咪唑組采用20mg／kg劑量灌胃，以上給藥或給誰(shuí)均每日1次，共治療30d。

3．4 樣本采集：正常對(duì)照組和模型組于第3次注射免疫1周后出現(xiàn)口腔潰瘍后采集外周血，于用藥后第30天對(duì)左旋咪唑組進(jìn)行采集。從各組大鼠眼眶采血，常規(guī)抗凝后離心，取上清的血清，裝入高溫已滅菌的EP管，－70℃冰箱中保存待測(cè)。

4 觀察指標(biāo) 密切觀察并記錄模型組及左旋咪唑組大鼠發(fā)生潰瘍的持續(xù)時(shí)間、數(shù)目及間隔時(shí)間。同時(shí)采用直接免疫熒光標(biāo)記全血溶血法流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3與CD4的表達(dá)情況，采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS12．0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用±s表示，對(duì)比采用LSD－t檢驗(yàn)，P＜0．05代表差異顯著。

結(jié) 果

1 潰瘍相關(guān)指標(biāo)對(duì)比 經(jīng)過(guò)觀察，模型組大鼠發(fā)生口腔潰瘍的數(shù)據(jù)明顯多于左旋咪唑組大鼠發(fā)生潰瘍的數(shù)目，同時(shí)潰瘍間隔時(shí)間延長(zhǎng)、持續(xù)時(shí)間縮短，兩組對(duì)比差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)表1。

表1 不同組別潰瘍持續(xù)時(shí)間、發(fā)生數(shù)目及間隔時(shí)間的變化（±s）

表1 不同組別潰瘍持續(xù)時(shí)間、發(fā)生數(shù)目及間隔時(shí)間的變化（±s）

注：與對(duì)照組相比＊P＜0．05

組 別 n 潰瘍數(shù)目 持續(xù)時(shí)間 間隔時(shí)間（d）20 19．25±3．12 3．00±0．64 2．05±0．16左旋咪唑組 20 9．63±3．00＊2．21±0．55＊ 8．80±0．20模型組＊

2 T淋巴細(xì)胞亞群的變化 經(jīng)過(guò)觀察，與對(duì)照組相比，模型組的大鼠外周血中的CD4＋細(xì)胞比例明顯降低，而左旋咪唑組的大鼠外周血中的CD4＋細(xì)胞比例高于模型組，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；3組的大鼠外周血中的CD8＋細(xì)胞比例對(duì)比差異都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見(jiàn)表2。

表2 不同組別外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化（%，±s）

表2 不同組別外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化（%，±s）

注：與對(duì)照組相比＊P＜0．05，與模型組相比＃P＜0．05

組 別 n CD4＋ CD8＋20 49．50±3．52 19．62±3．40模型組 20 41．43±4．63＊ 17．68±2．36左旋咪唑組 20 55．89±4．00＃對(duì)照組20．27±2．99

3 血清因子的變化 經(jīng)過(guò)觀察，與對(duì)照組相比，模型組的大鼠血清中SOD活性降低，MDA含量升高，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。左旋咪唑組與模型組相比，大鼠血清中SOD活性升高，MDA含量降低，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)表3。

表3 不同組別血清SOD和MDA的變化（±s）

表3 不同組別血清SOD和MDA的變化（±s）

注：與對(duì)照組相比＊P＜0．05，與模型組相比＃P＜0．05

組 別 n SOD（U／ml） MDA（nmol／ml）20 328．62±40．58 5．58±0．18模型組 20 230．50±51．23＊ 8．26±0．21＊左旋咪唑組 20 230．25±45．36＃ 8．10±0．19對(duì)照組＃

討 論

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是最常見(jiàn)的口腔黏膜病，臨床表現(xiàn)為口腔黏膜反復(fù)出現(xiàn)孤立的圓形或橢圓形的淺表潰瘍，有自愈性、周期性、復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)。其中免疫、遺傳和環(huán)境可能是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)病的“三聯(lián)因素”［4］。

研究表明復(fù)發(fā)性口腔潰瘍會(huì)造成患者的淋巴細(xì)胞功能降低及T淋巴細(xì)胞亞群失衡，其中T淋巴細(xì)胞亞群異常對(duì)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展有重要作用［5］。其中T淋巴細(xì)胞按其功能可分為CD8＋和CD4＋兩個(gè)亞群，其中CD8＋為T(mén)殺傷－抑制亞群，而CD4＋為T(mén)輔助－誘導(dǎo)亞群，當(dāng)其數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，機(jī)體會(huì)發(fā)生免疫紊亂從而導(dǎo)致發(fā)病。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者外周血中的CD4＋／CD8＋下降，CD4＋細(xì)胞數(shù)量下降，而CD8＋細(xì)胞數(shù)量正常，因此細(xì)胞免疫功能低下是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)病和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一［6］。本文結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組的大鼠外周血中的CD4＋細(xì)胞比例明顯降低，而左旋咪唑組的大鼠外周血中的CD4＋細(xì)胞比例高于模型組，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；3組的大鼠外周血中的CD8＋細(xì)胞比例對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。該結(jié)果與之前研究的結(jié)果基本一致，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物模型可作為免疫失衡的動(dòng)物模型。

研究證實(shí)，氧自由基可能是連接復(fù)發(fā)性口腔潰瘍各種致病因素的共同樞紐環(huán)節(jié)，氧自由基在體內(nèi)的聚集可降解為MDA，可對(duì)細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)及透明質(zhì)酸等產(chǎn)生廣泛的損傷作用。不過(guò)人體內(nèi)存在著一套完備的抗氧化防御系統(tǒng)，其中每種抗氧化劑的活性高低都可以間接評(píng)價(jià)氧自由基的活動(dòng)。現(xiàn)代藥理研究表明左旋咪唑具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，其可以增強(qiáng)機(jī)體的非特異性及特異性免疫功能［7］。且左旋咪唑抗氧化作用很強(qiáng)，可顯著提高小鼠的非特異性免疫能力，且存在一定劑量效應(yīng)。對(duì)混合淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞有增強(qiáng)作用，并能促進(jìn)大鼠脾細(xì)胞分泌相關(guān)白介素細(xì)胞因子［8］。本文結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組的大鼠血清中MDA含量升高，SOD活性降低，對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。而左旋咪唑組與模型組相比，大鼠血清中SOD活性升高，MDA含量降低，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

總之，T淋巴細(xì)胞亞群的失衡和血清相關(guān)因子在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，左旋咪唑可以有效的治療大鼠復(fù)發(fā)性口腔潰瘍，具體機(jī)制在于調(diào)節(jié)免疫功能與細(xì)胞因子的變化。

［1］ 房 棟，趙東盈．蒙脫石散與琥珀酸氫化可的松聯(lián)合保留灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎60例［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2013，42（11）：1558－1559．

［2］ 陳永梅，周作華，趙 穎，等．脂氧素受體激動(dòng)劑BML－111對(duì)左向右分流大鼠肺動(dòng)脈壓力影響及其機(jī)制的研究［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2013，42（5）：518－520．

［3］ 郎江蓉，武云霞．復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者唾液及血清中TNF－α的表達(dá)及其相關(guān)性研究［J］．實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（3）：353－355．

［4］ 孫勤國(guó)，江 波，崔曉燕，等．口瘍清方對(duì)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍模型大鼠免疫功能的研究［J］．中西醫(yī)結(jié)合研究，2013，5（2）：66－68．

［5］ 龐世權(quán)，陳 茵，余海清，等．長(zhǎng)春瑞濱加醛氫葉酸和大劑量氟尿嘧啶治療晚期三陰性乳腺癌［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（34）：75－76．

［6］ 程 茜，劉建國(guó)，郭玉書(shū)，等．實(shí)驗(yàn)性SD大鼠ROU模型的建立［J］．臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（9）：563－565．

［7］ 石展鵬．復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的中醫(yī)治療與研究進(jìn)展［J］．陜西中醫(yī)，2011，32（2）：247－250．

［8］ 祁 晶，余占海，劉 燕，等．免疫法建立SD大鼠RAU模型［J］．口腔醫(yī)學(xué)研究，2010，26（6）：816－819．