吉非替尼聯合5－氟尿嘧啶對肺癌細胞株A549的影響及機制研究＊

西安交通大學醫學院第一附屬醫院 （西安710061）

崔 潔△ 王敏聰 郭亞煥▲ 宋麗萍

肺癌是最常見惡性腫瘤之一，其中約80%為非小細胞肺癌，惡性程度高，總體5年生存率僅為15%，大多數患者就診時為中晚期，化療和分子靶向治療是治療的主要手段，但容易出現耐藥［1］。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR－TKI）包括吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼，目前被NCCN指南推薦用于晚期非小細胞肺癌的治療，通過干預EGFR酪氨酸激酶信號轉導抑制腫瘤細胞的存活、血管生成、增殖、細胞遷移、細胞侵襲及轉移等過程［2］。然而，EGFR－TKI只對部分患者有效，且經過一定時間的治療后出現疾病進展，即發生了獲得性耐藥，這種耐藥可能與EGFR基因的二次突變有關［3，4］。因此，克服 EGFR－TKI的原發性和獲得性耐藥是一項重要的研究課題。

本實驗將探討5－氟尿嘧啶聯合吉非替尼對A549細胞的影響及其機制，為提高非小細胞肺癌患者對EGFR－TKI的敏感性提供新的思路。

材料和方法

1 材 料 人肺腺癌細胞株A549由西安交通大學醫學院中心實驗室提供，吉非替尼由英國阿斯利康公司提供，5－氟尿嘧啶購自上海旭東海普藥業，PⅠ染料購自Sigma公司，RPMⅠ－1640培養液和胎牛血清購自四季青公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自自碧云天生物技術有限公司，MTT購自Sigma公司，DNA提取試劑盒購自TakaRa寶信生物工程有限公司，流式細胞儀為美國BD公司，p－EGFR購自Cell Signaling Technology，EGFR 購自bioworld technology，β－actin購自sinopept company。

2 方 法

2．1 細胞培養：將人A549細胞系培養于含10%胎牛血清、100U／ml青霉素及100ug／ml鏈霉素的PRMI－1640培養基中，置于含5%CO2、100%飽和濕度、37℃孵箱中培養，隔天傳代。

2．2 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細胞增殖：取對數生長期A549細胞，調整細胞濃度為1×104／ml，接種于96孔培養板，置37℃，5%CO2培養箱內培養24h，加入不同濃度的5－Fu（1．2，2．4，4．8，8．6，17．2，34．4μmol／L）和吉非替尼（1．6，3．2，6．4，12．8，25．6，51．2μmol／L）48h后檢測，每個濃度設3個復孔。藥物聯合作用的檢測，每孔內分別加入含有終濃度為0．125，0．25，0．5，1，2倍IC50濃度的吉非替尼以及0．125，0．25，0．5，1，2，4倍IC50濃度的5－Fu共同孵育，48h后終止培養，每個濃度設3個復孔，每孔加入MTT20μL，避光培養4h后去培養液，每孔加入DMSO150μL，于振蕩器上搖勻后于酶標儀上測OD492值，同時設立陰性對照和無細胞空白對照。計算細胞抑制率＝（實驗組平均A值／對照組平A值）×100%。采用直線回歸方法計算藥物的半數抑制濃度（IC50）。實驗重復3次。

2．3 吉非替尼和5－氟尿嘧啶的聯合效應：根據中效原理，采用Chou－Talalay方法判定2種藥物的聯合作用。按中效方程式計算出不同抑制率時兩藥的單用和聯用濃度，通過單藥和二藥合用量效關系參數計算聯合用藥效應值與二藥單用效應值的關系，求出各抑制水平的聯合指數（Combination Index，CI），如果 CI＜1，認為兩藥物聯用為協同作用；如果CI＝1，認為兩藥聯用為相加作用；如果CI＞1，則認為兩藥聯用為拮抗作用。

2．4 應用流式細胞術檢測凋亡：取對數生長期A549細胞，接種于6孔培養板，調整細胞濃度為1×105／孔，12h后分別應用吉非替尼（5μmol／L），5－氟尿嘧啶（4．8μmol／L），吉非替尼聯合5－氟尿嘧啶處理細胞，同時應用1／1000DMSO作為陰性對照，48h后終止培養，胰酶消化，PBS洗滌，棄上清，加入200μL試劑盒提供的結合緩沖液，重懸細胞后，分別加入10μLAnnexinV－FITC和5μLPI，輕輕混勻，4℃避光反應30min，再加入300μL結合緩沖液，上機檢測。

2．5 應用流式細胞術檢測細胞周期：取對數生長期A549細胞，接種于6孔培養板，調整細胞濃度為1×105／孔，12h后應用吉非替尼（5μmol／L）處理細胞，同時應用1／1000DMSO作為陰性對照，48h后終止培養，0．25%胰酶消化，1500r／min離心5min，棄上清，用冷PBS洗滌2次，70%酒精固定4℃過夜，離心后去上清，用冷 PBS洗滌2次，加入500μLAssay Buffer＋10μLRNase A＋10μLPI，避光室溫孵育30min，上機檢測。

2．6 Western－blot檢測：取對數生長期A549細胞，接種于6孔培養板，調整細胞濃度為1×105／孔，12h后分別應用吉非替尼（5μmol／L），5－氟尿嘧啶（4．8μmol／L），吉非替尼聯合5－氟尿嘧啶處理細胞，同時應用1／1000DMSO作為陰性對照，48h后終止培養，收集細胞，提取蛋白，并用紫外吸收法測定蛋白濃度。SDS－PAGE分離蛋白后進行轉膜，將轉上蛋白的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于含5%脫脂奶粉的Tris鹽緩沖液－吐溫液（TBST）中封閉1h，TBST漂洗。分別加入抗人EGFR／p－EGFR一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10min。然后再加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，在室溫下孵育1h后，充分漂洗，最后采用電化學發光法進行顯像，暗室中進行X射線曝光壓片，再顯影，定影，得到目的蛋白條帶。實驗重復3次，用β－αctin作為內參。

結 果

1 吉非替尼和5－氟尿嘧啶對非小細胞肺癌A549細胞的增殖抑制 應用MTT法分別檢測吉非替尼和5－氟尿嘧啶作用于非小細胞肺癌A549細胞48h的增殖抑制效應，研究結果顯示，隨著藥物濃度的提高，細胞抑制率逐漸增高，48h半數抑制率（IC50）見附表。

附表 半數抑制率（±s）

附表 半數抑制率（±s）

藥物 吉非替尼（μmol／L） 5－氟尿嘧啶（μmol／L）IC50 12．3±1．5 8．8±1．7

2 吉非替尼和5－氟尿嘧啶聯合應用具有協同效應 應用 MTT法檢測聯合0．125，0．25，0．5，1，2倍IC50濃度的吉非替尼和0．125，0．25，0．5，1，2倍IC50濃度的5－氟尿嘧啶對A549細胞增殖的抑制效應，然后采用Chou－Talalay聯用指數法判定2種藥物的聯合作用。研究結果顯示吉非替尼和5－氟尿嘧啶聯用具有協同效應，CI值＜1，隨著藥物濃度增高，CI值逐漸減小，協同效應更加顯著。

3 聯合吉非替尼和5－氟尿嘧啶對A549細胞凋亡的影響 應用流式細胞術檢測吉非替尼（5μmol／L），5－氟尿嘧啶（4．8μmol／L），吉非替尼聯合5－氟尿嘧啶作用于A549細胞48h后對細胞凋亡的影響，同時應用1／1000DMSO作為陰性對照，研究結果顯示吉非替尼或5－氟尿嘧啶單獨作用A549細胞48h后，細胞凋亡率分別為1．35%±0．5%和1．41%±0．7%，陰性對照組0．81%±0．2%；吉非替尼和5－Fu聯合作用于A549細胞的凋亡率為7．23%±1．5%，高于單獨用藥組，差異有統計學意義（P＜0．05）。

4 吉非替尼對A549細胞細胞周期的影響 吉非替尼（5μmol／L）單獨作用于A549細胞48h后，與陰性對照相比較，S期細胞明顯增多62．18%±15．5%vs31．25%±9．1%，差異有統計學意義（P＜0．05）。

5 聯合吉非替尼和5－氟尿嘧啶對A549細胞EGFR／p－EGFR的影響 5－氟尿嘧啶（4．8μmol／L）單獨作用于A549細胞48h，對EGFR／p－EGFR表達無顯著影響；吉非替尼（5μmol／L）單獨作用于A549細胞48h，p－EGFR表達下調；聯合應用吉非替尼和5－Fu48h顯著下調A549細胞p－EGFR表達水平，附圖 。

附圖 Western－blot檢測吉非替尼、5－氟尿嘧啶及聯合用藥對A549細胞EGFR／p－EGFR的影響

討 論

隨著肺癌分子發病機制的研究，針對這些機制的靶向治療藥物逐漸進入臨床，其中EGFR是目前研究最多的肺癌治療靶點。EGFR含有1個與配體結合的胞外區，1個跨膜區和1個具有酪氨酸激酶活性的胞內受體區。當表皮生長因子、轉化生長因子、雙調蛋白等配體與EGFR結合后，進行同源或異源二聚化，引起胞內酪氨酸殘基自身磷酸化，活化的受體募集信號復合體并活化下游信號轉導蛋白，影響細胞周期和凋亡，參與控制細胞的存活、血管生成、增殖、細胞遷移、細胞侵襲及轉移等過程［5～7］。吉非替尼是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，其通過競爭性地與EGFR酪氨酸激酶催化區域中的Mg－ATP位點結合，抑制酪氨酸激酶磷酸化，阻斷EGFR的信號轉導通路，從而抑制細胞周期進程，加速細胞凋亡，是最早應用于治療非小細胞肺癌的靶向藥物，與傳統的放化療相比，具有依從性好、不良反應少等明顯的優點。雖然部分非小細胞肺癌患者可從中獲益，但不可避免地，此類藥物同樣存在耐藥的同題，包括原發性耐藥和獲得性耐藥。因此如何提高藥物敏感性，克服耐藥已成為目前國內外研究的熱點之一。

本研究顯示吉非替尼和5－Fu聯合作用于非小細胞肺癌A549細胞具有協同效應。進一步的研究發現，吉非替尼能夠使S期細胞比例顯著增多，聯合應用這兩種藥物顯著提高A549細胞的凋亡，并顯著下調p－EGFR表達水平。5－Fu為抗嘧啶類抗代謝藥物，在體內轉變成5－氟尿嘧啶脫氧核苷酸，抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻斷脫氧尿苷酸轉變成脫氧胸苷酸，從而影響DNA生物，主要作用于S期。因此我們推測吉非替尼可能通過增加S期細胞，下調p－EGFR表達水平，提高凋亡率來增加對5－Fu的敏感性。A549細胞為EGFR野生型并含有K－RAS突變，對EGFR－TKI產生原發性耐藥。本研究發現5－Fu能夠增加A549細胞對EGFR－TKI的敏感性，該結果為克服肺腺癌對EGFRTKI原發性耐藥提供一種新的治療策略。目前國外有研究表明，聯合應用吉非替尼和S1作用于T790M突變的肺腺癌細胞株H1975，具有協同作用，該細胞對EGFR－TKI產生獲得性耐藥，機制與吉非替尼可以增加胸苷酸合成酶的表達，提高S1的敏感性有關［8］。

5－Fu為卡培他濱或S1的體內代謝產物，目前這兩種藥物均在進行II－III期臨床試驗［9］，有望應用于非小細胞肺癌的治療。我們的研究結果提示吉非替尼與卡培他濱或S1聯合應用在克服吉非替尼原發性耐藥方面是一種有希望的治療策略。進一步可以開展動物實驗，但是否可真正用于臨床上對EGFR－TKI靶向藥物治療原發耐藥的NSCLC的治療，還需要進行更多、更深入的研究來評估。

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