西安地區(qū)腸道病毒71型手足口病患兒細(xì)胞免疫功能的臨床研究＊

西安市中心醫(yī)院感染科 （西安710003） 付建軍 王 燁 王巧俠 馬朝峰 雷彩虹 趙怡生

手足口?。℉and foot mouth disease，HFMD）是由腸道病毒感染以手足掌、臀部、口腔等部位出現(xiàn)暗紅色皮疹或皰疹為臨床特征的一種急性傳染病。能夠引起手足口病的病毒以腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）及柯薩奇病毒 A16型多見［1］，通常情況下，EV71感染者更易發(fā)展為重癥和危重癥。研究報道［2］：在甲型 H1N1感染時，患兒外周血 CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋均下降，提示患兒感染H1N1時其細(xì)胞免疫功能受到抑制。本研究通過檢測腸道病毒71型手足口病患兒急性期外周血T淋巴細(xì)胞亞群，以探討西安地區(qū)腸道病毒EV71手足口病患兒急性期體內(nèi)細(xì)胞免疫的狀態(tài)及其在發(fā)病機(jī)制中的作用，為臨床判斷病情進(jìn)展、預(yù)測預(yù)后及臨床診治提供依據(jù)。

資料與方法

1 臨床資料 隨機(jī)選取2011年4月至2012年8月在我科收治且確診為腸道病毒EV71型手足口病的患兒共100例，年齡最大5歲，最小8月。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《手足口病診療指南（2010年版）》［3］。據(jù)病情將患兒分為重癥組：40例（男22例，女18例）；普通組：60例（男33例，女27例）；對照組：20例（男11例，女9例），為同期在本院查體的同齡健康兒童。各組患兒在性別、年齡方面經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理無顯著性差異（P＞0．05），具有可比性。

2 檢測方法

2．1 標(biāo)本的收集：經(jīng)患兒家長知情并同意后，于發(fā)病第1～5天由我科一名專職護(hù)士采集患兒空腹外周血靜脈2ml，并置入EDTA抗凝管。

2．2 儀器和試劑：FAcScalibur流式細(xì)胞儀購自美國 Beckon Dickinson公司，BD MUltiTest IMkkit和BD Cailibrit 4Beads（流式細(xì)胞儀標(biāo)準(zhǔn)試劑）等全部為進(jìn)口試劑。

2．3 T淋巴細(xì)胞亞群的檢測：采集外周靜脈血2ml，置入EDTA抗凝后，進(jìn)樣管中加入20ul四色抗體試劑和100ul抗凝全血，充分混勻，室溫避光15min，加入2ml 10倍稀釋的溶血素，充分混勻。室溫避光10min，1500r／min離心5min，棄上清液，用PBS洗滌2次后垂懸，混勻后用流式細(xì)胞儀檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組樣本比較采用方差分析；計數(shù)資料采用卡方檢驗，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 重、輕癥手足口病及對照組急性期外周血總T淋巴細(xì)胞、抑制性T淋巴細(xì)胞以及輔助性T淋巴細(xì)胞百分率及CD4＋／CD8＋比值比較 見表1。總T淋巴細(xì)胞、抑制性T淋巴細(xì)胞以及輔助性T淋巴細(xì)胞百分率在重、輕癥手足口病組及對照組間具有顯著性差異（P＜0．05）。三組間 CD4＋／CD8＋比值比較無顯著性差異（P＞0．05）。

表1 三組間的CD3＋CD19－、CD3＋CD8＋、CD3＋CD4＋百分率及CD4＋／CD8＋比值比較（±s）

表1 三組間的CD3＋CD19－、CD3＋CD8＋、CD3＋CD4＋百分率及CD4＋／CD8＋比值比較（±s）

注：分別與輕癥手足口病組比較，＊P＜0．01；＊＊P＜0．05；＊＊＊P＞0．05

組 別 n CD3＋CD19－ CD3＋CD8＋ CD3＋CD4＋ CD4＋／CD8＋4±0．384輕癥手足口病 60 0．674±0．0927 0．220±0．070 0．387±0．045 1．924±0．602重癥手足口病 40 0．604±0．100 0．189±0．064 0．283±0．034 1．949±2．148 F 13．557＊ 3．732＊＊ 199．577＊ 0．301健康對照組 20 0．727±0．067 0．226±0．024 0．504±0．042 2．18＊＊＊

2 重、輕癥手足口病組與對照組急性期外周血NK（CD16＋CD56＋）、（BCD19＋）比較 見表2。三組間NK細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞間均無顯著性差異（P ＞0．05）。

表2 三組患者NK（CD16＋CD56＋）、B（CD19＋）比較（±s）

表2 三組患者NK（CD16＋CD56＋）、B（CD19＋）比較（±s）

注：＊ 三組間比較，P＞0．05

20 0．132±0．059 0．147±0．067輕癥手足口病 60 0．137±0．058 0．147±0．067重癥手足口病 40 0．148±0．069 0．170±0．076 F 值 0．591＊ 3．732淋巴細(xì)胞健康對照組組 別 n NK細(xì)胞 B＊

討 論

近5年來腸道病毒71型已成為引起手足口病的主要病原體［4］，且腸道病毒71型手足口病患兒病情更易發(fā)展為重癥或危重癥［5］。目前關(guān)于EV71感染所致的重癥手足口病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。有研究表明［6］：嬰幼兒感染EV71病毒后易形成重癥手足口病，可能與其免疫功能不成熟有關(guān)。故推測EV71手足口病患兒的發(fā)病機(jī)制可能與病毒的直接損傷和免疫損傷有關(guān)［7］。細(xì)胞免疫是人體免疫系統(tǒng)重要的組成部分，人體正常的細(xì)胞免疫的維持依賴于輔助T淋巴細(xì)胞和抑制T淋巴細(xì)胞是否處于一個相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，如果這種平衡狀態(tài)被破壞，那么機(jī)體的細(xì)胞免疫功能將發(fā)生紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)：重、輕癥手足口病組患兒外周血總T淋巴細(xì)胞百分率、輔助性T淋巴細(xì)胞百分率、抑制性T淋巴細(xì)胞百分率，與對照組相比較有明顯下降；重癥手足口病組上述三個指標(biāo)明顯低于輕癥手足口病組。這表明EV71手足口病患兒細(xì)胞免疫功能受到不同程度的抑制，這種抑制程度與患兒病情輕重有關(guān)，重癥手足口病組細(xì)胞免疫功能抑制的程度更加嚴(yán)重。另外我們還發(fā)現(xiàn)CD4＋／CD8＋比值在三個實驗組間無明顯差異，我們推測可能與下列因素有關(guān)：①手足病患兒急性期，CD4＋和CD8＋均受到抑制，但抑制的程度一致，故在整體比值上無變化。②可能與我們?nèi)脒x重癥的病例偏少，造成偏差所致。

NK細(xì)胞是人體重要的自然殺傷細(xì)胞，在機(jī)體抗病毒自然免疫中發(fā)揮著重要作用。而CD16＋CD56＋是活化的NK細(xì)胞重要表面分子。我們研究還發(fā)現(xiàn)，急性EV71手足口病患兒外周血CD16＋CD56＋在重、輕癥組及對照組之間無顯著性差異，我們推測其原因是在抗原提呈細(xì)胞通過胞膜接觸和分泌細(xì)胞因子途徑上調(diào)NK細(xì)胞活性時，淋巴細(xì)胞通過分泌L1～10等細(xì)胞因子下調(diào)NK細(xì)胞的活性［10］，使其在整體上無明顯變化。CD19＋是B細(xì)胞特有的表面標(biāo)志，參與B細(xì)胞的活化。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：CD19＋在重、輕癥手足口病及對照組間無明顯差異，其原因：當(dāng)EV71感染患兒時，B細(xì)胞雖然受到刺激，但還未開始分裂和分泌大量免疫球蛋白樣抗體，或分泌量少，故導(dǎo)致三間無明顯差異，故關(guān)于B細(xì)胞的變化仍需動態(tài)檢測其變化。

總之，腸道病毒71型手足口病患兒于急性期細(xì)胞免疫功能明顯受到抑制，因此在密切監(jiān)測病情的同時，動態(tài)檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群，及時了解和評價患兒細(xì)胞免疫功能情況，對那些有重癥傾向的患兒進(jìn)行及早干預(yù)和治療，有可能降低其發(fā)展為重癥或危重癥的發(fā)生率，從而降低病死率。

［1］ Solomon T，Lewthwate P，Perea D，et al．Virology epidemiology pathogenesis and control of enterovirus 71［J］．Lancet Infect Dis，2010，10（11）：778－790．

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［3］ 中華人民共和國衛(wèi)生部．手足口病治療指南（2010年版）［J］．國際呼吸雜志，2010，30（24）：1473－1475．

［4］ 黃學(xué)勇，郭萬中，馬 宏，等．2009年河南省腸道病毒EV71基因型特征分析［J］．中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，44（5）：469－471．

［5］ Lin YW，chang KC，Kao CM，et al．Lymphocyte and antibody response reduce enterovirus 71lethality in mice by decreasing tissue viral loads［J］．J Virol，2009，83（13）：6471－6483．

［6］ Wang JN，Yao CT，Yeh CN，et al．Critical management in patients with sever enteroviras 71infection［J］．Pediatr Int，2006，48（3）：250－256．

［7］ 祖 瑩，李德發(fā)，曹 科，等．CD8＋細(xì)胞毒性T細(xì)胞的反應(yīng)質(zhì)量在EV71HFMD病程中的作用［J］．國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（20）：2328－2333．