苦丁茶不同采收期多糖含量的動態累積分析

黃敏桃，吳尤嬌，蔡鵑，黃云峰，賴茂祥，黃庶識，劉華鋼

（1.廣西科學院生物物理實驗室，廣西南寧530007；2.廣西生態工程職業技術學院，廣西柳州545004；3.廣西中醫藥大學藥學院，廣西南寧530001；4.江西省贛州衛生學校，江西贛州341000；5.廣西中醫藥研究院，廣西南寧530022；6.廣西醫科大學，廣西南寧530021）

苦 丁 茶 （Ilex Kudingcha C．J．Tseng）是 冬 青 科（Aquifoliaceae）冬青屬喬木植物，別名菠蘿樹、大葉茶、苦燈茶、苦登茶，主產于湖南、湖北、廣東、廣西、海南等省。因采摘嫩梢加工制作而成，沖泡后具有先苦后甘的愉快口感，飲后余味猶存而得名，由苦丁茶冬青葉制成的苦丁茶是民間常用中草藥和飲品，是傳統中成藥“甘和茶”的主要原料之一。據《廣西萬承苦丁茶》一書記載：早在元朝期間就被指定為朝廷“貢茶”，其價值由此可見一斑。葉（苦丁茶）苦、甘、涼，主要含有三萜皂苷及甾醇、茶多酚、黃酮、生物堿、氨基酸、維生素、苦味素和對人體有益的多種微量元素[1]。具有清熱解毒，祛暑，主要用于治療頭痛、齒痛、目赤、熱病煩渴、痢疾等癥[2]。近年對苦丁茶的多糖研究較多，但是對苦丁茶多糖的月份累積未見報道。本研究選取廣西1-12月份的大葉冬青苦丁茶作為樣品，采用苯酚-硫酸比色，紫外可見分光光度計測定其多糖的含量，分析苦丁茶不同生長期多糖含量的動態變化規律，為苦丁茶合理采用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥材、試劑與儀器

廣西苦丁茶樣品采自廣西南寧市地委大院，為冬青科冬青屬苦丁茶冬青，采回后晾干，粉碎，備用。

濃硫酸（分析純）：廉江市愛廉化試劑有限公司；苯酚（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水。

瑞士梅特勒-托利多超越型分析天平：Mettler Toledo XS105DU；紫外分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；循環水式真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；超聲儀：上海必能信超聲有限公司；數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

2 方法與結果

2.1 試驗條件的確定

2.1.1 最佳提取條件

本研究對常溫浸提、超聲提取、加熱回流3種方法進行單因素考察，結果表明加熱回流能大大的提高了多糖的浸出率。在單因素考察基礎上采用響應面法考察了提取溫度、提取時間及液料比對多糖浸出率的影響，確定溫度為98℃、提取時間2 h、液料比為63∶1時為多糖提取最優提取條件，進行多糖的提取。

2.1.2 測定方法

選擇苯酚-硫酸法是利用糖類在濃硫酸作用下，水解成糠醛或其衍生物與苯酚縮合產生有色物質，其顏色深淺與糖的濃度成正比。

2.1.3 測定波長

配制一定濃度的葡萄糖標準溶液，以相應試劑為空白，分別在400 nm～800 nm處掃描，結果在482 nm處有最大吸收值。

2.2 苦丁茶多糖含量的測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取經105℃干燥至恒重的無水葡萄糖純品20.03 mg，用水定容于100 mL容量瓶中，再精密吸取10.00 mL定容至50 mL容量瓶中，得到40.06 ug/mL葡萄糖溶液，再分別精密吸取葡萄糖溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，并用水補足至 2.0 mL，得系列對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備

精密稱取苦丁茶粉末5.000 g，置于圓底燒瓶內，加蒸餾水至315 mL，稱重，98℃加熱回流2 h，冷卻后加蒸餾水補足重量，將濾液稀釋20倍，備用。

2.2.3 苯酚-濃硫酸比色試劑的配制

精密稱取苯酚3.0 g，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，配置成6%的苯酚溶液，硫酸為濃硫酸試劑。

2.2.4 樣品溶液的顯色與測定

取上述樣品供試品溶液2 mL置于10 mL比色管中，精密加入6%的苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，室溫靜置30 min后測定。

2.3 試驗方法的考察

2.3.1 標準曲線的制備

將上述系列對照品溶液分別置于10 mL試管中，分別加入1 mL 6%苯酚溶液及5.0 mL濃硫酸，待各管加完后搖勻，室溫靜置30 min，482 nm測吸光度，再精密吸取2.0 mL蒸餾水，同法操作，作為空白對照。以吸光度為縱坐標（y），葡萄糖濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，得回歸方程為y=0. 01311x+0. 03864，R2=0. 9979，得出標準曲線（圖1）。

圖1 葡萄糖標準溶液曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.3.2 精密度試驗

精密度試驗結果見表1。

表1 精密度試驗結果Table 1 Result of precision test

按2.2.4方法連續測定對照品溶液的吸光度，測得的RSD為1.05%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗

穩定性試驗結果見表2。

表2 穩定性試驗結果Table 2 Result of stability test

按2.2.4方法每隔5 min測一次樣品溶液的吸光度，連續測24次，測得的吸光度RSD為2.80%。結果表明，樣品溶液在2 h內顯色穩定。

2.3.4 重復性試驗

重復性試驗結果見表3。

表3 重復性試驗結果Table 3 Result of repeatability test

按2.2.4方法制備6份7月采收的苦丁茶樣品的制成的供試品溶液，測定其多糖含量平均值為68.9 mg/g，RSD為2.75%。結果表明，試驗的重復性好。

2.3.5 加樣回收率試驗

加樣回收率試驗結果如表4。

表4 樣品回收率試驗及結果Table 4 Result of recovery test

按2.2.4方法測定5個不同濃度樣品的回收率，回收率在95%～105%之間，平均回收率為98.618%，RSD為1.96%（＜2%）。

2.4 樣品含量測定

按2.2.2項下樣品溶液的制備方法對12個月份的廣西苦丁茶樣品進行制備供試品溶液，再按樣品溶液的顯色與測定方法在波長為282 nm下進行多糖含量的測定，得到各月份不同含糖量。樣品含量測定結果見表5及圖2。

表5 不同采收期的廣西苦丁茶多糖含量（n=3）Table 5 Content of polysaccharide of Ilex kudingcha C.J.Tseng in different months from Guangxi（n=3）

圖2 不同采收期苦丁茶多糖含量變化規律（n=3）Fig.2 Curves of content polysaccharide of Ilex kudingcha C.J.Tseng in different months

3 討論

多糖又稱多聚糖（P．1ysaccharide），由單糖聚合成聚合度大于l0的極性大分子，分子量為數萬至數百萬，糖類與核酸、蛋白質、脂質一起合稱為生命活動所必需的四大類化合物。研究表明，苦丁茶多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基具有一定的清除作用，對H2O2誘導紅細胞氧化溶血反應，對紅細胞自氧化溶血反應都有顯著的抑制作用[3-5]。這一系列的藥理研究引起廣泛關注，多糖含量的研究具有重要的意義。目前多糖含量測定應用方法最多的是苯酚-硫酸法[6]，但在不同的文獻報道中硫酸的加入量不同而影響多糖含量的測定結果[7]。本試驗考察了樣品液、6%苯酚及濃硫酸比例分別為2∶1∶5和2∶1∶7。結果顯示比例為2∶1∶5所測出來的含糖量比較高，與有些文獻所說的2∶1∶7結果較好有所差別[8]，原因有可能是儀器響應值的不同以及試劑的純度有差別。苯酚-硫酸法具有操作簡單、靈敏度高、顯色穩定等優勢，其檢測結果可為多糖的研究開發及應用提供參考依據。

苦丁茶原產于廣西大新縣，是廣西的一種道地藥材，廣西苦丁茶不同月份多糖含量分析的結果顯示，4月份含糖量達到最高，而后慢慢下降，在11月份是含量有所提升，但是也不及4月5月的含量，12月份含量最低，如果以苦丁茶多糖生物活性作為標準，4、5月份可作為苦丁茶最佳采收期。4、5月份在廣西南寧地區的氣溫回暖，雨水逐漸增多，多糖含量隨著升高，可能與植株為了滿足新芽的萌發將貯存的營養轉化為可溶性糖有關。此研究結果可為苦丁茶資源的有效采摘及合理應用提供參考依據。

[1] 劉祖生.苦丁茶化學成分研究[J].浙江農業大學學報,1992,18(5)：66-69

[2] China National Corporation of Traditional arm Herbal Medicine(中國藥材公司).Handbook of Chinese Traditional Medicine Resources(中國中藥資源志要)[M].Beijing：Science Press,1994：689

[3] 王新,何玲玲,劉彬.苦丁茶冬青葉多糖的分離純化及其對羥自由基的清除作用[J].食品科學,2008,29(6)：37-39

[4] Kit Man Lau,Z.-D.He.anti-inflammatory and hepato-protective effects of Ethnopharmacology[J].Ethnopharmacol,2002,83(1/2)：63-71

[5] 吳曉鵬,王一飛,劉秋英,等.苦丁茶多糖抗氧化活性研究[J].食品與發酵工業,2008(2)：34-36

[6] 崔紅華,李超英,張大方,等.用苯酚一硫酸法測定人參多糖含量的研究[J].中國中醫藥信息雜志,1999,6(2)：2

[7] 劉曉河,梁惠花,譚曉紅.茵陳中多糖的含量測定[J].中草藥,2003,34(6)：519

[8] 王新,陸慧寧,林少琨.苦丁茶冬青葉多糖的提取及含量測定[J].時珍國醫國藥,2006,17(10)：1977-1979