米糠多糖的免疫增強(qiáng)作用

劉梁，孫維礦，趙玲，李赫宇，陳新，*

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

米糠是一種具有很大潛力的優(yōu)質(zhì)食品原料，國內(nèi)外都非常重視米糠的開發(fā)利用[1]。米糠多糖有著很好的生理功能，較強(qiáng)的抗腫瘤和降血清膽固醇功能，對提高免疫力和降低血糖水平等也有一定功效，可用于藥品、保健營養(yǎng)品及化妝品的原料或添加劑，有著較廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域[2-8]。近20年來，對多糖免疫活性的研究是免疫藥理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[9-10]。前期工作中，我們通過提取、膜分離、醇沉、酶解、冷凍干燥等手段從米糠中提取分離得到不同純度和分子量的米糠多糖 SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4。本文主要通過研究以上4種米糠多糖樣品對體外小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響，以及樣品對細(xì)胞因子IFN-γ，IL-2，IL-10，IL-12，IL-17分泌的影響，考察米糠多糖的免疫增強(qiáng)作用，為進(jìn)一步揭示 SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4 免疫增強(qiáng)作用的機(jī)理提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

由本實(shí)驗(yàn)室從米糠中分離得到的米糠多糖SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4。CCK-8 試劑盒：日本同仁化學(xué)；二甲基亞砜（DMSO，分析純）、胎牛血清：FBS，上海玉博生物科技公司；RPMI-1640培養(yǎng)液：青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌脂多糖：LPS，Sigma公司；刀豆蛋白-A：ConA，Sigma公司。

1.2 儀器和設(shè)備

SpectraMax M2e酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板：上海市求精生化試劑儀器有限公司；24、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國Corning公司；XS204型Mettler Toledo分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；CO2培養(yǎng)箱：美國Revco公司；HITACHI-CR22G高速冷凍離心機(jī)：日本日立電器公司；UV-5800PC型紫外-可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠多糖樣品溶液的配制及小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的制備

分別稱取25 mg米糠多糖 SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液溶解并定容到100 mL，過濾除菌后，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，備用。

將C57BL/6小鼠用頸椎脫臼的方法處死，75%酒精浸泡消毒，在無菌條件下取其脾臟，剔除結(jié)締組織，先用生理鹽水清洗3次，然后放入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用剪刀將脾臟剪成碎片后，用毛玻片輕柔研磨，過200目不銹鋼細(xì)胞篩，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗網(wǎng)篩，收集濾過的細(xì)胞懸液，離心（ 2000 r/min）10 min，棄上清液，用適量含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至所需濃度（細(xì)胞活率95%以上），備用。

1.3.2 活性測定

1.3.2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

CCK-8法是用于測定細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒性試驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。CCK-8被細(xì)胞內(nèi)脫氧酶生物還原后生成的橙色甲瓚染料能夠溶解于組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。不同濃度的多糖樣品與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)48 h，考察樣品對淋巴細(xì)胞活力的影響作用，觀察樣品是否有細(xì)胞毒性或促進(jìn)細(xì)胞的活化及增殖活性。具體操作：小鼠脾臟淋巴細(xì)胞（8×105個(gè)/孔）接種于96孔板，同時(shí)加入不同濃度250、50、10、2、0.4、0.08、0.016 μg/mL 的樣品，對照組樣品濃度為0，并以含10%FBS的1640培養(yǎng)液補(bǔ)至相同體積受試樣品，對照組樣品濃度為0，并以含10%FBS的1640培養(yǎng)液補(bǔ)至相同體積。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)24或48 h。培養(yǎng)結(jié)束前8 h向每孔加入20μL CCK-8溶液。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值。

1.3.2.2 絲裂原ConA、LPS誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

常規(guī)制備5×106個(gè)/mL脾臟淋巴細(xì)胞懸液，于96孔板中每孔加100 μL不同濃度受試樣品，加入50 μL不同濃度受試樣品，同時(shí)加入ConA（終濃度5 μg/mL或1 μg/mL）50 μL誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化增殖，或者LPS（終濃度 10 μg/mL 或 1 μg/mL）50 μL 誘導(dǎo) B 淋巴細(xì)胞活化增殖，另設(shè)相應(yīng)的陽性對照及無刺激本底對照。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前8小時(shí)摻入0.25 μCi 3H-thymidine。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)板凍存于-20℃冰箱，待測。用3H摻入法測定細(xì)胞增殖。

1.3.2.3 絲裂原ConA、LPS誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子

24孔培養(yǎng)板中小鼠脾細(xì)胞5×106個(gè)/孔，同時(shí)加入受試藥物及 ConA（5 μg/mL）或 LPS（10 μg/mL），另設(shè)相應(yīng)刺激對照（僅加入細(xì)胞和刺激劑）和無刺激對照（只有細(xì)胞，無刺激劑），并加入相應(yīng)體積含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，終體積2 mL。細(xì)胞于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集上清液，采用ELISA法檢測上清液中細(xì)胞因子濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠多糖對小鼠脾臟細(xì)胞體外活性的影響

不同濃度的多糖樣品與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)48 h，對淋巴細(xì)胞活性的影響如圖1中所示。

圖1 米糠多糖對體外正常小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響Fig.1 The influence of rice bran polysaccharide on the activity of spleen lymphocytes of normal mice in vitro

細(xì)胞活力=（加藥組OD值-培養(yǎng)液本底對照組OD值）/（溶媒對照組OD值-培養(yǎng)液本底對照組OD值）×100%，細(xì)胞活力：＞100%顯示樣品沒有直接的細(xì)胞毒性，細(xì)胞有活化增殖的現(xiàn)象；＜75%顯示樣品具有細(xì)胞毒性作用，影響細(xì)胞的存活；control組，溶媒對照；OD值均為酶標(biāo)儀中自動減去培養(yǎng)液本底對照組OD值后的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了CCK-8法檢測了米糠多糖樣品對小鼠脾臟細(xì)胞活力影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在未加絲裂原刺激條件下，米糠多糖SPK-1在濃度為250、50、10、2 μg/mL時(shí)均對小鼠淋巴細(xì)胞有顯著促進(jìn)增殖作用，SPK-2在濃度為250 μg/mL時(shí)對小鼠淋巴細(xì)胞有顯著促進(jìn)增殖作用，SPK-3在濃度為250、50 μg/mL時(shí)對小鼠淋巴細(xì)胞有顯著促進(jìn)增殖作用；SPK-4在濃度為250 μg/mL時(shí)對小鼠淋巴細(xì)胞有顯著促進(jìn)增殖作用。米糠多糖4個(gè)樣品與小鼠淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)均未見明顯的細(xì)胞毒性。

2.2 受試米糠多糖樣品在ConA/LPS分別誘導(dǎo)的脾臟T/B淋巴細(xì)胞活化增殖中的影響作用

受試米糠多糖樣品在ConA/LPS分別誘導(dǎo)的脾臟T/B淋巴細(xì)胞活化增殖中的影響作用見圖2。

圖2 米糠多糖對ConA誘導(dǎo)的脾臟T淋巴細(xì)胞增殖中的影響作用Fig.2 The influence of Rice bran polysaccharide on T lymphocytes proliferationspleen induced by ConA

增強(qiáng)/抑制百分比=（受試樣品組CPM值-刺激對照組CPM值）/（刺激對照組CPM值-細(xì)胞對照組CPM值），數(shù)值﹥0，說明樣品促進(jìn)細(xì)胞增殖，數(shù)值＜0，說明樣品抑制細(xì)胞增殖。

在本試驗(yàn)中，分別檢測了受試樣品在ConA5μg/mL，ConA1μg/mL（低濃度，低水平誘導(dǎo)劑量），LPS10μg/mL，LPS 1 μg/mL（低濃度，低水平誘導(dǎo)劑量）絲裂原誘導(dǎo)的脾臟淋巴細(xì)胞活化增殖中的影響作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試樣品分別在正常劑量和低劑量的ConA/LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活化增殖反應(yīng)中，分別有輕度的增強(qiáng)或抑制作用，但就每個(gè)樣品來看沒有明確的趨向性，即濃度梯度依賴性的影響作用。

圖3 米糠多糖對LPS誘導(dǎo)的脾臟B淋巴細(xì)胞增殖中的影響Fig.3 The influence of Rice bran polysaccharide on Spleen B lymphocyte proliferationspleen induced by LPS

2.3 受試樣品對ConA、LPS誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞活化分泌細(xì)胞因子的影響作用

運(yùn)用ELISA方法檢測受試米糠多糖樣品對LPS、ConA誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞活化分泌IFN-γ，IL-2，IL-10，IL-12，IL-17等細(xì)胞因子的影響作用，結(jié)果見圖4～7。

圖4 米糠多糖對ConA誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響Fig.4 Effects of rice bran polysaccharide on ConA induced IL-2 secretion of spleen lymphocytes

圖5 米糠多糖對ConA誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的影響Fig.5 Effects of rice bran polysaccharide on ConA induced IFN-γ secretion of spleen lymphocytes

圖6 米糠多糖對LPS誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-10的影響Fig.6 Effects of rice bran polysaccharide on LPS induced IL-10 secretion of spleen lymphocytes

圖7 米糠多糖對LPS誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-17的影響Fig.7 Effects of rice bran polysaccharide on LPS induced IL-17 secretion of spleen lymphocytes

實(shí)驗(yàn)選取了 25、5、1 μg/mL 3 個(gè)濃度的樣品，檢測相應(yīng)濃度下樣品對ConA、LPS誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞活化分泌細(xì)胞因子的影響。

白細(xì)胞介素-2（IL-2）主要是T淋巴細(xì)胞分泌的一種淋巴因子，在機(jī)體免疫方面具有重要作用，是一種免疫增強(qiáng)劑，具有抗病毒、抗腫瘤和提高免疫力的作用，我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) SPK-2（25 μg/mL、1 μg/mL）、SPK-3（25 μg/mL）SPK-4（5 μg/mL）都能夠顯著促進(jìn)IL-2的分泌。

干擾素-γ（IFN-γ）主要是由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，稱為Ⅱ型干擾素，通常由抗原與有絲分裂原誘導(dǎo)產(chǎn)生。干擾素具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。SPK-1（25 μg/mL，5 μg/mL）、SPK-4（25 μg/mL，5 μg/mL）均能促進(jìn)ConA誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ；而SPK-4在1 μg/mL的米糠多糖樣品卻顯著抑制了IFN-γ的分泌。

白細(xì)胞介素-10（IL-10）是一種多功能負(fù)性調(diào)節(jié)因子，主要是由Th2細(xì)胞、活化的B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它參與免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞的生物調(diào)節(jié)。IL-10具有很強(qiáng)免疫抑制及免疫調(diào)控作用，IL-10還是某些腫瘤細(xì)胞的生長因子，在本試驗(yàn)中，SPK-3在25 μg/mL濃度下對LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-10有顯著的促進(jìn)作用；而SPK-4 在 5 μg/mL，1 μg/mL 濃度下對 IL-10 分泌表現(xiàn)出顯著地抑制作用。

白細(xì)胞介素-17（IL-17）是一種前炎癥細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎性因子，與多種炎癥及自身免疫疾病有關(guān)。在本試驗(yàn)中 SPK-2（25、5、1 μg/mL）、SPK-3（5、1 μg/mL）、SPK-4（1 μg/mL）均能顯著抑制ConA誘導(dǎo)小鼠脾臟細(xì)胞分泌IL-17的作用。

3 結(jié)論

SPK-1：我們采用CCK-8法檢測米糠多糖樣品體外對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性作用影響，發(fā)現(xiàn)在250、50、10、2 μg/mL 濃度時(shí)，SPK-1 能顯著促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，且在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)沒有表現(xiàn)出顯著地毒性作用。我們用ELISA法檢測該樣品對細(xì)胞因子分泌的影響，觀察到樣品在25、5 μg/mL兩個(gè)濃度下，能夠顯著促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ。

SPK-2：采用同樣的方法，我們觀察到SPK-2在250 μg/mL時(shí)能夠顯著促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖；并且SPK-2在25、1 μg/mL濃度時(shí)能夠促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-2，且在25、5、1 μg/mL三個(gè)濃度下都能明顯抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-17。

SPK-3：采用同樣的方法，我們觀察到SPK-3在250、50 μg/mL時(shí)能夠顯著促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖；并且SPK-3在25μg/mL濃度時(shí)能夠促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-2以及LPS誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞分泌IL-10；SPK-3在5、1μg/mL濃度下能夠顯著抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-17。

SPK-4：采用同樣的方法，我們觀察到SPK-4在250 μg/mL濃度時(shí)能顯著促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，SPK-4在5、1 μg/mL能夠顯著促進(jìn)IL-2的分泌；在 25、5 μg/mL時(shí)能顯著促進(jìn) IFN-γ的分泌；在5、1 μg/mL時(shí)能夠抑制IL-10的分泌；在1 μg/mL時(shí)可明顯抑制IL-17分泌。

免疫活性測試結(jié)果表明：在CCK-8試驗(yàn)中，受試的這4種樣品在高濃度狀況下均沒有表現(xiàn)出顯著地細(xì)胞毒性，相反，卻表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，提示我們該系列樣品可能存在免疫促進(jìn)的作用；另外，在檢測該系列樣品對ConA或LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子時(shí)，我們觀察到該系列樣品對IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌存在顯著的促進(jìn)作用，也顯示相應(yīng)的樣品具有免疫增強(qiáng)作用。

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