HPLC法測定葡萄酒中白藜蘆醇的含量

柴菊華，孫曉偉，崔彥志，侍朋寶，朱鳳妹

（1.河北科技師范學院食品科技學院，河北秦皇島066600；2.朗格期酒莊秦皇島有限公司，河北秦皇島066600）

白藜蘆醇（Resveratrol），又稱芪三酚，化學名稱為3，4，5-三羥基-1，2-二苯乙烯，分子式為 C14H12O3，相對分子量為228.25，是葡萄酒中重要的功能性成分，具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗過敏、抗血栓、抗高血脂、消炎、掃除自由基等多種藥理活性，受到國內外醫學界和葡萄酒研究者的廣泛關注[1-9]。根據研究報道，葡萄品種、產區、釀造工藝、貯藏條件等因素影響葡萄酒中白藜蘆醇的含量[10－20]。本文通過HPLC法檢測了昌黎產區不同品種、年份和工藝釀造的葡萄酒中白藜蘆醇含量，為生產高白藜蘆醇含量葡萄酒提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

共29種葡萄酒，其中玫瑰香干白酒由河北科技師范學院釀酒工藝實驗室提供，其余28種酒樣均由朗格斯酒莊提供。

1.1.1 干紅葡萄酒

2008年年份酒：4種，分別是赤霞珠傳統罐貯和桶貯干紅酒、赤霞珠閃蒸罐貯和桶貯干紅酒；2009年年份酒：12種，包括赤霞珠傳統瓶貯和桶貯干紅酒，赤霞珠閃蒸瓶貯和桶貯干紅酒，品麗珠傳統和閃蒸瓶貯酒樣，北玫、西拉、馬貝克、小味兒多、馬瑟蘭、美樂傳統瓶貯干紅酒；2010年年份酒：2種，赤霞珠傳統和閃蒸瓶貯干紅酒。

1.1.2 干白葡萄酒

2010年年份酒：11種，即賽美蓉、白詩南、維奧尼、胡桑、增芳德、小芒森、霞多麗、雷司令、長相思、阿拉耐爾、玫瑰香瓶貯干白酒。

1.2 儀器

LC1200高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；KQ5200DB型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；AP-01P真空泵：天津市津南開發區南洋工業園；DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；Synergy超純水機：法國Millipore公司；FA 2004 B電子天平：上海精密科學儀器有限公司；旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司。

1.3 試劑

分析純乙酸乙酯；色譜純冰醋酸和甲醇；娃哈哈純凈水；反式白藜蘆醇標樣，純度為98%。

1.4 方法

1.4.1 標準曲線的繪制

1）反式白藜蘆醇標準曲線：準確稱取反式白藜蘆醇標準品2 mg，用色譜甲醇定容至10 mL，再分別配制成一定質量濃度的系列標準溶液，搖勻，經0.45 μm濾膜過濾上機測定。

2）順式白藜蘆醇的標準曲線：準確稱取反式白藜蘆醇標準品4 mg，用色譜甲醇定容至10 mL，再分別配制成一定質量濃度的系列標準溶液，經紫外線照射30 min，低溫靜置5 d，搖勻，經 0.45 μm 濾膜過濾后上機測定。

1.4.2 色譜條件

結合參考文獻與實驗室現有工作基礎，稍加改進，確定色譜條件：色譜柱為反相色譜柱Eclipse XDB C-18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇：1%乙酸水=35∶65（體積比）；流速為 1.0 mL/min；反式白藜蘆醇檢測波長為320 nm，順式白藜蘆醇檢測波長為305 nm；柱溫為30℃；進樣量為5 μL；DAD檢測器。

1.4.3 重復性試驗

采用標準品和酒樣溶液，重復進樣5次，得出峰時間和峰面積，計算RSD值。

1.4.4 酒樣中白藜蘆醇的提取

取50 mL葡萄酒，加50 mL乙酸乙酯，搖動萃取15 min，靜置分層后分液，將有機相40℃旋轉蒸發至干，殘留物用甲醇溶解定容至10 mL。上機測定前經0.45 μm濾膜過濾。操作過程中注意避光。

2 結果和分析

2.1 檢測波長的選擇

通過DAD檢測器在200 nm～400 nm范圍內對順反式白藜蘆醇標樣溶液進行光譜掃描，得到其光譜圖見圖1，圖1顯示出兩種同分異構體的光譜圖差異不大。用紫外分光光度計對2種標樣溶液在波長190 nm～400 nm區間內掃描，紫外吸收光譜圖顯示，2種標樣的最大吸收波長各不相同，反式白藜蘆醇的最大吸收波長是320 nm，順式白藜蘆醇的最大吸收波長是305nm。因此，分別選取320 nm和305 nm作為檢測反式和順式白藜蘆醇的檢測波長。

圖1 反式（A）和順式（B）白藜蘆醇的DAD光譜圖Fig.1 The DAD spectrum of trans-and cis-Resveratrol standards

2.2 標樣和酒樣色譜分離效果

反式白藜蘆醇在320 nm下的保留時間和順式白藜蘆醇在305 nm下的保留時間非常接近，均在10 min左右，所以不宜采用切換波長的方法進行同時測定，應設定兩個波長分別進行色譜分析。標樣和酒樣在選定色譜條件下峰形對稱，響應值大，無雜質干擾和基線漂移現象，色譜分離效果很好，見圖2。

2.3 白藜蘆醇標準曲線

以濃度為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，計算得到2條標準曲線：反式白藜蘆醇的濃度在0.5 mg/L～10mg/L之間，線性方程為Y=18. 9227829×X+0. 9602643，相關系數r=0. 99926；順式白藜蘆醇濃度在5 mg/L～200 mg/L之間，線性方程為Y=16. 2068315×X-5. 0812315，r=0. 99992。白藜蘆醇在研究范圍內線性關系良好，能夠滿足定量分析的要求。

表1 標樣和酒樣重復性實驗結果（n=5）Table 1 Results of repeated experiment of standard and a wine sample（n=5）

圖2 標樣和酒樣白藜蘆醇色譜圖Fig.2 Chromatoragrams of standard and a wine sample

2.4 重復性實驗

取2 mg/L反式白藜蘆醇標樣、20 mg/L順式白藜蘆醇標樣和2009年閃蒸赤霞珠瓶貯酒樣，連續測定5次，標樣和酒樣保留時間和峰面積相對標準偏差結果見表1。從表1可以看出順反式白藜蘆醇保留時間和峰面積重復性較好，保留時間的標準偏差在0.10%～0.12%，峰面積的標準偏差在0.95%～2.79%。

2.5 單品種干紅葡萄酒白藜蘆醇含量比較

2009年年份8種單品種干紅葡萄酒（瓶貯18個月）的白藜蘆醇含量存在顯著差異見表2：馬瑟蘭干紅酒反式白藜蘆醇含量最高，為6.22 mg/L，其次為美樂干紅酒，含量為0.93 mg/L，赤霞珠、品麗珠、小味兒多、北玫干紅酒中反式白藜蘆醇含量很少，西拉和馬貝克干紅酒未檢測出反式白藜蘆醇；美樂干紅酒順式白藜蘆醇含量最高，為34.52 mg/L，其次為西拉和馬瑟蘭干紅酒，含量分別為5.87 mg/L和5.57 mg/L，后面依次為馬貝克＞北玫、赤霞珠＞品麗珠、小味兒多；從白藜蘆醇總量看，美樂干紅酒高居首位，含量為35.45 mg/L，具有很高的醫療保健作用，其次是馬瑟蘭干紅酒，含量為11.79mg/L，后面依次為酉拉＞馬貝克＞北玫、赤霞珠＞品麗珠、小味兒多；干紅酒中反式白藜蘆醇含量明顯低于順式白藜蘆醇含量，僅占白藜蘆醇總量的12.19%，順式白藜蘆醇占總量的87.81%。

表2 8種單品種干紅葡萄酒白藜蘆醇含量Table 2 Concentration of trans-and cis-Resveratrol in eight dry red wines mg/L

2.6 單品種干白葡萄酒白藜蘆醇含量比較

陳釀6個月的11種單品種干白葡萄酒的白藜蘆醇含量有顯著差異見表3：增芳德順式、反式和總白藜蘆醇含量最高，分別為0.22、0.61、0.83 mg/L，其次為霞多麗干白酒，后面按白藜蘆醇總量排序依次為：胡桑＞玫瑰香＞阿拉耐爾＞雷司令＞小芒森＞長相思＞白詩南＞賽美蓉，維奧尼干白酒未檢測到白藜蘆醇。干白葡萄酒反式與順式白藜蘆醇平均含量分別占平均總量的57.69%和42.31%，但均遠遠低于干紅葡萄酒，分別為干紅葡萄酒的15.31%和1.56%，白藜蘆醇總量僅為干紅葡萄酒的3.23%。

表3 11種單品種干白葡萄酒白藜蘆醇含量Table 3 Concentration of trans-and cis-Resveratrol in eleven dry white wines mg/L

2.7 閃蒸與傳統干紅葡萄酒白藜蘆醇含量比較

閃蒸工藝顯著提高干紅葡萄酒白藜蘆醇含量見表4：2008年～2010年閃蒸赤霞珠干紅酒分別比傳統赤霞珠干紅酒白藜蘆醇總量提高了35.61%、318.31%和57.48%；2009年閃蒸品麗珠干紅酒分別比傳統品麗珠干紅酒白藜蘆醇總量提高了436.60%；閃蒸干紅酒白藜蘆醇總量比傳統干紅酒平均提高了118.45%。閃蒸處理提高白藜蘆醇含量的效果與年份、葡萄品種、制作工藝、貯藏方式等因素有關。

表4 閃蒸和傳統紅葡萄酒白藜蘆醇含量Table 4 Concentration of trans-and cis-Resveratrol in dry red wines made by flash realease technology and traditional technology mg/L

3 結論

1）29種葡萄酒平均反式白藜蘆醇含量為0.66 mg/L，占總量的7.99%，順式白藜蘆醇含量為4.53mg/L，占92.01%。

2）8種單品種干紅酒的白藜蘆醇含量存在明顯差異，平均白藜蘆醇含量為8.04 mg/L，總量范圍在1.29 mg/L～34.52 mg/L，其中美樂干紅酒含量最高，其次是馬瑟蘭和西拉干紅酒。

3）11種單品種干白酒的白藜蘆醇含量存在明顯差異，平均白藜蘆醇含量為0.26 mg/L，總量范圍在0 mg/L～0.83 mg/L，其中增芳德干白酒含量最高。

4）干紅酒白藜蘆醇含量遠遠高于干白葡萄酒，平均含量是其30.92倍。

5）6種閃蒸干紅酒白藜蘆醇平均含量為9.59 mg/L，而對照（6種傳統干紅酒）平均含量僅為4.39 mg/L，閃蒸工藝提高白藜蘆醇含量118.45%。

4 討論

反式白藜蘆醇標準溶液經紫外光直接照射30min，之后檢測其中的反式白藜蘆醇含量，發現反式標樣尚未轉化。靜置3 d～5 d后，意外發現320 nm檢測條件下檢測不到反式標樣，而305 nm檢測條件下出現了較大吸收峰，說明反式白藜蘆醇已完全轉化成順式白藜蘆醇，但其相應濃度的峰面積有所減小。另外，白藜蘆醇標樣和酒樣提取液應盡快上機測定，否則可能由于長時間存放導致白藜蘆醇的轉化影響測定結果的準確性。今后應進一步試驗反式白藜蘆醇標樣完全轉化成順式白藜蘆醇標樣的優化條件、順反式白藜蘆醇糖苷的快速檢測方法。

昌黎是我國第一個受到原產地保護的沿海地域，紫外線輻射強，葡萄生長季節氣候涼爽濕潤，對白藜蘆醇形成有利[9，11，13，16]。昌黎產區可選擇高產白藜蘆醇的優良品種美樂、馬瑟蘭、西拉等品種，在氣候條件允許的前提下盡量提高原料成熟度，結合閃蒸工藝等措施，開展高白藜蘆醇含量葡萄酒生產關鍵技術的集成研究，開發保健優質特色干紅葡萄酒。

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