液態(tài)奶中防腐劑高效液相色譜前處理方法比較

錢(qián)聰

（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

在食品中添加苯甲酸、山梨酸、糖精鈉是為了防止食品腐敗變質(zhì)，延長(zhǎng)保質(zhì)期和降低生產(chǎn)成本，然而過(guò)多食用會(huì)危害人體健康，對(duì)于人們?cè)陲嬍持胁豢扇鄙俚囊簯B(tài)奶而言，防腐劑的檢測(cè)保證其安全極其必要。液態(tài)奶中防腐劑檢測(cè)的前處理方法和沉淀劑的選擇尤為重要[1-3]，GB 21703-2010《乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測(cè)定》的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中樣品前處理選擇鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中需要用到酸和堿調(diào)節(jié)pH沉淀蛋白，過(guò)程較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。針對(duì)液態(tài)奶中防腐劑檢測(cè)的前處理方法找到最佳的沉淀劑，更簡(jiǎn)便，更快速，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵所在。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲醇（色譜純)：美國(guó)fisher公司；乙酸銨、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀均為分析純：汕頭市西隴化工廠；乙酸、硫酸、氫氧化鈉，分析純：北京化工廠。

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（Agilent公司，美國(guó)），配Agilent G1315 B二極管陣列檢測(cè)器。

1.3 樣品前處理

1.3.1 方法一

GB21703-2010乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀法：準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g樣品于25 mL比色管中，然后加入4 g/L氫氧化鈉6 mL，超聲水浴處理15 min，再用30 ml/L硫酸調(diào)pH到8，再加106 g/L亞鐵氰化鉀和219 g/L乙酸鋅各2 mL，劇烈振搖后用甲醇定容。

1.3.2 方法二

0.2%乙酸沉淀法：準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g樣品于25 mL比色管中，加入15 mL 0.2%乙酸水溶液，渦旋2 min，用0.2%乙酸水溶液人定容至刻度。

1.3.3 方法三

甲醇沉淀蛋白：準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g樣品于25 mL比色管后，用甲醇定容搖勻。

經(jīng)上述處理后，提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，高效液相色譜分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

濃度分別為：0.005、0.010、0.025、0.050、0.100mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣體積為10 μL。

1.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAXEclipseXDB-C18柱：5μm，4.6mm×250 mm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流動(dòng)相：甲醇—5 mmol/L乙酸銨溶液（3∶97）。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

比較了兩種流動(dòng)相的條件，分別為甲醇+乙酸銨（5∶95）、甲醇+乙酸銨（3∶97），由于在糖精鈉出峰前有雜質(zhì)峰干擾，最后選用甲醇+乙酸銨（3∶97）作為最佳條件，在此條件下3種防腐劑和樣品中干擾物能達(dá)到較好的基線分離，而且出峰時(shí)間適中，色譜條件的測(cè)定結(jié)果令人滿意，見(jiàn)圖1。

圖1 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉分別在兩種流動(dòng)相的條件下分離情況Fig.1 Benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in two kinds of mobile phase conditions separation

2.2 樣品前處理方法研究

如何使乳品中的蛋白質(zhì)完全沉淀并得到滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果這是此次實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵所在，在本次試驗(yàn)中做了如下的試驗(yàn)比較：第一：在幾個(gè)沉淀劑的選擇上做出了比較，首先考慮了乙腈和乙醇作為沉淀劑，但從峰形和加標(biāo)回收率上來(lái)看均不理想；第二：在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的復(fù)雜程度上做出了比較，在國(guó)標(biāo)方法中需要用到酸和堿，還要調(diào)pH，相對(duì)于直接用0.2%乙酸或者甲醇沉淀蛋白的方法，操作過(guò)于繁瑣；第三：從沉淀效果上做出比較，用0.2%乙酸作為沉淀劑的沉淀效果好，容易過(guò)濾。3種前處理方式雖然在操作過(guò)程中和沉淀效果上都有所差異，但在色譜圖上顯示均能實(shí)現(xiàn)與基質(zhì)成分的基線的分離，定量并未受到干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉分別在甲醇（a）、0.2%乙酸（b）、國(guó)標(biāo)（c）前處理方法的譜圖Fig.2 The benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in methanol（a），0.2%acetic acid（b），national standard（c）spectra pretreatment methods

2.3 線性和檢出限

在選定的色譜條件下，在0.005mg/mL～0.100mg/mL范圍內(nèi)3種食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，見(jiàn)表1。

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

取不含苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的鮮乳樣品，加入高中低3個(gè)濃度梯度的防腐劑混標(biāo)，加標(biāo)濃度分別為50、12.5、2.5 mg/L，按照上述3種方法進(jìn)行前處理，分別測(cè)定5次，計(jì)算其回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 線性回歸方程和檢出限Table 1 Regression，correlation coefficient and detection limit

空白鮮乳樣品中加標(biāo)50 mg/L苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的色譜圖分別見(jiàn)圖3、圖4、圖5，圖中均可看出苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與基質(zhì)成分得到基線分離。

表2 3種方法加標(biāo)回收率和精密度的實(shí)驗(yàn)（n=5）Table 2 Recovery（%）and relative standard deviation（RSD）（%）

圖3 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在方法1中色譜圖Fig.3 The benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in method 1 Chromatogram

圖4 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在方法2中色譜圖Fig.4 The benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in method 2 Chromatogram

圖5 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在方法3中色譜Fig.5 The benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in method 3 Chromatogram

3 結(jié)論

在本次實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)3種前處理方法的比較可以看出，國(guó)標(biāo)方法前處理采用酸、堿調(diào)節(jié)pH，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀蛋白，操作繁瑣，而0.2%乙酸水溶液和甲醇沉淀蛋白的方法操作簡(jiǎn)單，相比而言前者的沉淀效果更好，提取液易于過(guò)濾。從加標(biāo)回收率和精密度來(lái)看，3種方法均能滿足液態(tài)奶中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的實(shí)際檢測(cè)需求。在液相測(cè)定中，需要減小有機(jī)相的比例，使基質(zhì)成分不會(huì)干擾糖精鈉的測(cè)定。

[1] 王克新,房玉國(guó),張立宏,等.HPLC法測(cè)定乳制品中的苯甲酸和山梨酸含量[J].中國(guó)乳品工業(yè),2006(4)：54-55

[2] 盧麗明，周日東，黃誠(chéng)，等.含乳飲料中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉測(cè)定的樣品前處理方法探討[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué),2005(6)：43-44

[3] 劉賜敏,周金森,劉鈺釵,等.HPLC測(cè)定乳制品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的前處理方法研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006(11)：1315-1316