基于TTC染色法的高活力酵母細胞定量篩選*

徐俊，雍曉雨，費文斌，周俊，2，王舒雅，2，陳怡露，鄭濤，2

1(南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京，211816)

2(南京工業大學 生物能源研究所，江蘇南京，211816)

2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)是一種顯色劑，能夠對多種細胞(酵母，細菌，植物細胞等)發生呈色反應。TTC本身為無色，但能被活細胞中的呼吸鏈脫氫酶將無色的氧化態TTC還原為紅色的TTF(Triphenyl formazan)［1］。TTF存在于細胞內，且不溶于水，經有機溶劑萃取，在一定波長下其吸光值的大小反映了細胞膜電子傳遞鏈遞氫能力的大小。且細胞內TTC反應所呈現的紅色的深淺反映了其生命活力的強弱，顏色越深表明其活力越強。由于TTC的上述特點，TTC染色法被廣泛應用于種子、微生物細胞呼吸活性［2-4］等的檢測，例如Ogur等用TTC篩選酵母的呼吸缺陷株［5］;劉華等人利用TTC法測定紅豆杉細胞活力［6］;王躍華等人利用TTC法測定滇重樓細胞活力并優化測定條件［7］;楊天佑等人利用TTC-脫氫酶測定法研究低溫真空環境對細菌呼吸活性的影響［8］。TTC染色法也被應用于高產乙醇酵母的篩選［9-10］。在酵母細胞中，乙醇發酵的主要途徑包括葡萄糖酵解和丙酮酸的無氧降解，在此過程中糖-乙醇轉化酶起主要作用，TTC能對酵母的代謝產物產生顯色反應，通過其顏色的深淺可以判斷其胞內轉化酶活力的大小，顏色越深表明其細胞活性越強，產乙醇能力也越強［11］。

現有的篩選高產乙醇酵母的方法還存在較多缺陷。第1是含有TTC培養基的平板制作復雜，接種酵母后生長比較緩慢，并且后續挑取顏色較深的酵母時，操作也比較繁瑣，需時較長;第2是利用人眼觀測通過TTC染色法的呈色反應后顏色的深淺來判斷細胞活力從而預測酵母產乙醇能力的高低，由于待篩選細胞繁多，很容易產生疲勞和誤差，影響細胞篩選的準確度和效率。本實驗探索利用TTC染色法和96孔板培養酵母細胞，通過酶標儀在一定波長下檢測，定量、快速、可靠地直接反應細胞活力，能夠顯著降低篩選時間及降低操作過程中的視覺判斷產生的人為誤差。

1 材料與方法

1.1 菌株

酵母菌株#1-#23(共23 株)，J-10，J-19，J-27，OY-11(由本實驗室保藏)。

1.2 培養基

YPD斜面培養基:1 L培養基含10 g酵母粉，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉。

YPD液體培養基:1 L培養基含10 g酵母粉，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖。

1.3 酵母細胞活力檢測方法的建立

1.3.1 有機溶劑選擇

根據實驗設計，需選擇價格低廉、萃取效果好、毒性較低、并且對細胞培養板無腐蝕性的有機溶劑作為萃取劑。將培養好的酵母細胞菌液分別加入1 mL乙酸乙酯、甲醇、丙酮、二甲基亞砜，振蕩后離心，取200 μL上清液加入酶標板中，用酶標儀檢測其TTF吸收值。

1.3.2 有機溶劑最佳濃度的選擇

取1 mL在含有TTC的培養液中培養好的酵母細胞菌液10 000 r/min離心1 min后棄上清液，加入1 mL不同體積分數的二甲基亞砜溶液(100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%)，充分混勻后10 000 r/min離心1 min，取200 μL上清液加入酶標板中，用酶標儀檢測其TTF吸收值。

1.3.3 TTF最大吸收波長的確定

取1 mL培養好的酵母細胞液，10 000 r/min離心1 min后棄上清液。加入1 mL體積分數為85%的二甲基亞砜溶液，振蕩后離心機10 000 r/min離心1 min，取200 μL上清液加入酶標板中，用酶標儀進行全波長掃描，檢測TTF吸收值，檢測波長范圍為200～1 000 nm，步長為1 nm。

1.3.4 TTF 標準曲線的繪制［7，12］

分別取 1 mL 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 g/L的TTC溶液加入10 mL離心管中，加入2 mL pH8.4 Tris-HCl和1 mL 10 g/L的Na2S2O4溶液，37℃水浴振蕩5 min(以上步驟均在暗處操作)，使得TTC完全還原為TTF。將上述反應液10 000 r/min離心10 min后棄上清液，加入5 mL體積分數為85%的二甲基亞砜溶液并充分混勻，于486 nm處測吸光值，并以此為縱坐標，以TTC濃度作為橫坐標繪制標準曲線，繪制得到的標準曲線。

1.3.5 培養體系中TTC濃度的確定

設置YPD培養基中TTC質量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L。將培養好的酵母種子液按10%的接種量分別接入含有以上TTC濃度的YPD培養基中，200 r/min 30℃培養12 h。分別取1 mL培養好的菌液，10 000 r/min離心1 min后棄上清液，再分別加入1 mL二甲基亞砜溶液，充分混勻后10 000 r/min離心1 min，取200 μL上清液加入酶標板中，用酶標儀檢測其TTF吸收值。

1.3.6 培養液pH的確定

設置YPD培養基中pH分別為1～14，將培養好的酵母種子液按10%的接種量分別接入以上pH的YPD培養基中，200 r/min 30℃培養12 h。分別取1 mL菌液10 000 r/min離心1min，棄上清液，再分別加入1 mL二甲基亞砜溶液，充分混勻后10 000 r/min離心1 min，取200 μL上清液加入酶標板中，用酶標儀檢測其TTF吸收值。

1.3.7 待檢測酵母細胞培養

取100 μL待檢測酵母細胞菌液涂布于YPD固體平板培養基上，30℃培養48 h后挑取單菌落轉移至96孔細胞培養板。96孔細胞培養板中加入150 μL的YPD培養液，并設置最終體積分數為0、10%、14%的乙醇，30℃ 200 r/min培養4 h后，測定其OD600值。將上述酵母細胞培養液4 000 r/min離心5 min后棄上清液，在96孔細胞培養板各孔中加入150 μL體積分數為85%的二甲基亞砜溶液，振蕩15 s后4 000 r/min離心5 min待測。添加不同體積分數的乙醇，是為了檢測在不同乙醇體積分數下待測菌株的細胞活力，這樣既可以用該方法檢測同一株菌在有無乙醇及乙醇體積分數高或低的處理下細胞活力，還可以檢測并比較不同菌株在同一乙醇體積分數下的活力，以此選擇耐乙醇的菌株。

1.3.8 TTF值的測定

吸取100 μL上述細胞培養板中振蕩離心后的上清液到96孔酶標板中，在486 nm下測定TTF吸收值，根據TTF標準曲線及步驟1.3.2中測定的細胞OD600值，計算細胞內TTF含量，計算公式為:TTF含量=實驗測得TTF吸收值×(1/細胞OD600吸收值)，以所得到的在標準曲線線性范圍內的TTF值確定細胞呼吸力即細胞活力大小。TTF含量越高，表明細胞活力越強。

1.3.9 各菌株乙醇產量的測定

使用氣相色譜內標法測定各株菌株的乙醇產量。選用SGE 30QC2/AC20-0.25毛細管柱，柱箱溫度60℃，進樣器溫度190℃，檢測器溫度240℃，內標物為正丙醇，檢測液為6%正丙醇溶液與被測樣品混合液，檢測液配置方法:取0.5 mL 6%正丙醇溶液和0.5 mL被測樣品加入10mL容量瓶，加水定容至10 mL，測定時檢測液進樣量為2 μL。通過氣相色譜內標法測定各株菌的乙醇產量后，通過各株菌對應的胞內TTF值，確定TTF值與乙醇產量的關系，最后篩選出具有較強活力的菌株。

2 結果與討論

2.1 檢測方法中實驗參數的確定

2.1.1 有機溶劑選擇

表1為二甲基亞砜等所選4種有機溶劑的胞內TTF提取效果比較。首先所選用的有機溶劑必須能夠最大程度地提取出胞內所形成的TTF結晶。由表1可知，用二甲基亞砜提取TTF結晶時，其上清液中TTF吸收值達到1.127，分別為使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯時的1.19、1.55、1.80倍，在3種有機溶劑中效果最好。同時，考慮到有機溶劑對于96孔酶標板的腐蝕性，會對實驗結果產生影響。相比于其他3種有機溶劑，二甲基亞砜對96孔酶標板無腐蝕性，在酶標儀檢測時，所測實驗數據真實可信。而且，二甲基亞砜價格較低，相比于其他幾種有機溶劑毒性較低。經綜合考慮，本實驗選用二甲基亞砜作為TTF提取劑。

表1 有機溶劑提取胞內TTF效果比較Table 1 Comparison of intracellular TTF extracted by organic solvent

2.1.2 有機溶劑最佳濃度的選擇

二甲基亞砜最佳濃度的選擇結果見表2。由表2可知，體積分數為100% ～85%的二甲基亞砜提取TTF結晶，上清液TTF吸收值都達到1.15左右，效果基本相當。當體積分數為80%時，吸收值為1.109，有一定程度的下降。當體積分數低于80%時，TTF吸收值有很明顯的下降，且隨二甲基亞砜濃度的降低而降低，故實驗中選用體積分數為85%的二甲基亞砜溶液。

表2 不同稀釋比例二甲基亞砜提取效果比較Table 2 Comparison of the extraction effect of different dilution ratio dimethyl sulfoxide

2.1.3 TTF最大吸收波長的確定

全波長掃描圖譜見圖1。由圖1可知，在486 nm處TTF有一明顯的吸收峰，故本實驗選用486 nm作為TTF吸收峰的檢測波長。

2.1.4 TTF標準曲線的繪制

圖1 TTF的全波長掃描Fig.1 Absorbance spectrum of TTF

按照1.3.1章節所述準備標準曲線制作的反應液，并以混合液于486 nm處吸光值為縱坐標，TTC濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程為Y=-0.000 9+14.72X，R2=0.995 6。當 TTC濃度在0.01% ～0.06%時，OD值在0.15～0.88，兩者呈較好的線性關系，可以用于定量測定。當OD值低于0.15或者高于0.88時，即認為超出可信區間，在此基礎上測得的值認為不可取。標準曲線是為了檢測細胞生成的TTF值落在一個可信的區間內，不在這個區間的認為這個值不可信。

2.1.5 培養體系中TTC濃度的確定

由圖2可知，在TTC濃度為0.4%時所測的TTF的吸收值最高，超過這一濃度后TTF吸收值下降。這是由于TTC本身具有一定的毒性，過高的TTC濃度本身對細胞活性有一定的影響，溶液中積累TTC濃度越高，對細胞活性影響越大，細胞生長越慢，即細胞OD值越低。0.05% ～0.2%時測得的TTF吸收值偏低，原因可能是由于溶液中TTC的含量太少，不足以測得培養液中所有酵母群體的活性。因此，本實驗選定反應體系中的TTC濃度為0.4%。

圖2 TTC濃度對酵母細胞生長的影響Fig.2 Effect of TTC concentration on the yeast culture

2.1.6 培養液pH的確定

由圖3可知，反應液的pH ＜6時，測得的TTF吸收值很小，當反應液的pH在8～9時，所測得TTF吸收值較大，其中在pH為8時測得TTF吸收值最大。當pH ＞10時，所測得吸收值很小。其原因有:當pH值較低時，由于細胞處于較為不適的生長pH環境，所以生長較為緩慢，測得的細胞OD值也較低。當pH在中性微偏堿環境下時，酵母細胞處于較為適應的生長環境，其生長較快，且有最大活性，因此，測得細胞OD值也較高。當pH值超過10時，堿性環境不利于細胞生長，隨pH值降低，生長速度減慢，其細胞OD值也較低。故實驗中反應體系的pH值應控制在pH 8左右。

圖3 培養液pH對酵母活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of yeast

2.2 酵母活性及乙醇產量檢測

根據1.3建立的檢測方法以及乙醇產量檢測方法，從本實驗室保藏的27株菌株中篩選出具有較強活力的6株菌株，按細胞活力強弱依次排列為#5，#1，#8，OY-11，#7，#6，實驗結果見表 3。

表3 酵母菌株活性及乙醇產量情況Table 3 Cell activity and ethanol yield of yeast strains

從表3中可以看出:在乙醇體積分數為0%，10%，14%時，菌株#5 TTF吸收值均為最高，分別達到0.819、0.795、0.365。菌株#5相比于其他5株菌，在有無乙醇壓力情況下都具有較為明顯的優勢，可見其活性在測試的所有菌株中最強，其他菌株按活性強弱依次為#1，#8，OY-11，#7，#6。同時測定菌株乙醇產量，菌株#5的乙醇產量也為最高，達到5.87 g/L，其他菌株按乙醇產量高低依次為#8，#1，OY-11，#7，#6。乙醇發酵過程中糖-乙醇轉化酶起主要作用，TTC能對酵母的代謝產物產生顯色反應，通過其顏色的深淺可以判斷其胞內轉化酶活力的大小。顏色越深，表明TTC在酵母胞內轉化為TTF結晶含量越高，既TTF吸收值較高，同時也可表明其胞內轉化酶活性越強，細胞活性也越強，而轉化酶活力的強弱與乙醇產量有關。酶活越高，產乙醇能力也越強。菌株#5在乙醇壓力為0%，10%，14%時都具有最高的TTF吸收值，也就表明其胞內轉化酶活性在所有菌株中最強，乙醇產量也最高，通過表3中乙醇產量可以看出，#5菌株比其他菌株高出5%左右。通過分析其他菌株的TTF吸收值與乙醇產量可以看出，TTF值下降，細胞活性降低，乙醇產量也有一定程度下降。由此得出，菌株的細胞活力與乙醇產量在一定程度上是成正相關的。

相比于原有研究中，王躍華等人報道TTC-脫氫酶還原法能夠檢測滇重樓地下莖的細胞活力，其目標為檢測細胞活性，而本研究所發明的TTC染色法用于酵母菌細胞活性的測定，使用96孔板及酶標儀快速檢測多株酵母，且最終目標定位于能夠通過比較TTF生成量與乙醇產量關系來篩選高產乙醇酵母菌株，同時，本研究所建立的方法中，TTC工作濃度僅為0.4%，僅為前人報道的1/2，因此，本方法具有準確、高效、操作簡單、經濟性等特點。

3 結論

(1)本實驗選用體積分數為85%二甲基亞砜作為TTF最佳提取劑，培養液中TTC濃度為0.4%，溶液pH8，TTF最大吸收波長為486 nm。通過檢測待測菌株在上述條件下培養后所測得的TTF吸收值，以及細胞OD值，可以通過公式TTF含量=實驗測得TTF吸收值×(1/細胞OD600吸收值)，計算出細胞內實際TTF值，以所得到的在標準曲線線性范圍內的TTF值確定細胞呼吸力即細胞活力大小。同時，測定待測菌株所對應的乙醇產量，可以得到細胞呼吸活力與乙醇產量的關系，即酵母呼吸活力與其乙醇產量在一定程度上呈正相關。

(2)本實驗所建立的基于TTC染色法的高活力酵母細胞定量篩選方法，相比于原有一些對于利用TTC染色法篩選酵母的研究中雖利用96孔板但沒有明顯減少實驗時間，以及在利用96孔板僅僅是對細胞群體密度的定量等相比，本方法具有準確性、高效性、操作簡單、經濟性等特點。

(3)本實驗所建立的方法可應用于高活性、高產乙醇酵母的篩選，也可用于其他微生物及植物細胞的活性檢測，為快速、大量檢測細胞活性提供一條新途徑。

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