大豆蛋白的可溶性水解物、可溶/不溶性聚集體對乳化香腸品質的影響*

簡華君，李鵬鵬，黃小林，陳潔

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

大豆分離蛋白(SPI)具有良好的凝膠性、乳化性、持油持水性等功能性質，因此被廣泛應用于乳化香腸、火腿腸等肉制品中，以此提高產品質構和得率［1］。然而，關于添加SPI對肉制品影響的研究報道卻存在不一致性。例如，Matulis等人指出添加3%的商業SPI增強了乳化香腸的硬度［2］;Pietrasik等人發現2%的商業SPI提高了肉凝膠強度［3］;Chin等人發現，添加2.2%商業SPI不影響乳化香腸的凝膠強度，但添加量為4.4%時削弱了香腸質構［1］;然而，Foegeding等人認為，大豆蛋白可能會對肉凝膠結構起負面效應［4］;McCord等人認為，添加商業SPI降低了肌肉蛋白的凝膠強度［5］;Feng等人指出，未經變性的native SPI對乳化香腸質構沒有影響，但經熱處理和Alcalase水解后的SPI則提高了香腸硬度［6］。可以推測，以上不一致結果很可能是因為所添加的native SPI、水解物和商業SPI結構不同、所含組分也不同導致的。

商業SPI在工業生產過程中，通常會經歷一定程度的變性和聚集，導致溶解度的降低，形成水不溶性的聚集體或沉淀［7-9］，同時也會形成一部分可溶性聚集體［10］。不同商業SPI的生產廠家由于工藝參數不同，可溶/不溶性聚集體比例不同，其產品的在肉制品中的應用效果往往也不盡相同。另外，酶解作為一種常見的蛋白改性方法常被用于破壞蛋白結構形成不同肽鏈片段，從而提高蛋白的功能性質［11］。SPI的酶解物已被報道可以改善肉制品的風味和保水性［12］。Feng等人曾報道SPI經Alcalase酶解后的可溶和不溶性混合水解物能夠顯著提高香腸的硬度［6］。

本研究探討了SPI的可溶性水解物、可溶/不溶性聚集體對乳化香腸肉糜流變學性質、香腸蒸煮得率、質構和微觀結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮豬后腿瘦肉、去皮豬肥膘，購于大潤發超市;腸衣為直徑2.2 cm的膠原蛋白腸衣，購自淄博龍寶生物食品有限公司;商業SPI，益海嘉里秦皇島金海工業公司提供;Alcalase堿性蛋白酶，美國Novozymes公司;HCl和NaOH等，為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司;大豆、鹽、糖等為市售。

1.2 儀器

Avanti J-26 XP高速冷凍離心機，美國Beckman公司;SevenEasy pH計，瑞士梅特勒-托利多公司;0.45 μm微濾膜(Type HV)和100 kDa纖維素超濾膜，美國Millipore公司;BJRJ-12T臺式絞肉機，嘉興艾博不銹鋼機械工程有限公司;CM-14斬拌機，西班牙Mainca公司;TB-46灌腸機，永康市泰寶電器五金廠;Rational Selfcooking center 61E蒸烤箱，德國Rational公司;AR-G2流變儀，美國 TA公司;TA-XT Plus質構儀，英國 Stable Micro Systems公司;XL-30 ESEM環境掃描電鏡，荷蘭Philips公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 天然大豆分離蛋白(SPI)的制備

大豆首先去皮、粉碎、脫脂［m(豆粉)∶V(正已烷)∶V(乙醇)=3∶9∶1］得到脫脂豆粕。參考Ramirez-Suarez等［13］的“堿溶 -酸沉 -中和”方法提取SPI并冷凍干燥(視為native SPI)、研磨成粉末，真空包裝后保存在-20℃冰箱中。

1.3.2 SPI酶解物的制備

按1.3.1制備的native SPI用超純水配制成質量分數為5.5%的溶液后，轉移至50℃循環水浴加熱的酶反應器中，用0.1 mol/L的NaOH調節pH 8.0后，添加堿性蛋白酶Alcalase(酶活≥2.4 U/g，酶底比為1∶100)，同時滴加0.1 mol/L的NaOH維持pH值為8.0，直至蛋白水解度達到4%。根據 pH-stat方法［14］計算達到目標水解度時需消耗NaOH的體積。達到目標水解度后，80℃水浴加熱15 min進行滅酶處理，放入碎冰中冷卻后離心(10 000 g，15 min，4℃)取上清液調節pH 7.0并冷凍干燥(視為可溶性水解物)。

1.3.3 SPI可溶/不溶性聚集體的制備

商業SPI首先分散在超純水中，配成質量分數1%的蛋白溶液，然后離心(10 000 g，15 min，4℃)。收集離心得到的沉淀，即為SPI的不溶性聚集體。離心得到的上清液首先通過0.45 μm的微濾膜去掉不溶性的蛋白大顆粒物質，然后利用100 kDa的纖維素超濾膜，被濃縮截留下來的蛋白部分即為分子量超過100 kDa的部分。根據分子質量分布測定可進一步確定該部分為分子質量大于1 000 kDa的可溶性聚集體。收集SPI可溶和不溶性聚集體分別冷凍干燥備用。將SPI可溶/不溶性聚集體干燥粉末按質量1∶1混合得到SPI混合聚集體。

1.3.4 乳化香腸的制備

1.3.4.1 基礎配方［6］

純SPI為2%，先用部分水溶脹SPI粉末為12%溶液，剩下冰水量斬拌時添加。

1.3.4.2 工藝流程

表1 添加不同SPI的乳化香腸配方Table 1 Formulation of emulsified sausages containing different soy protein isolate

1.3.4.3 關鍵操作要點

腌制:將糖、鹽、等腌料和絞過的瘦肉攪拌均勻，在4℃下腌制24 h。

斬拌:將腌好的瘦肉和肥肉先斬拌3min，再添加預溶脹的不同SPI斬拌3min，用碎冰控制溫度在10℃以下。

蒸煮:灌制好的乳化香腸均勻地放在蒸烤箱中，將溫度探頭插入一根香腸的幾何中心。80℃加濕蒸煮至中心溫度達到72℃，再快速冷卻至室溫。

1.3.5 流變性質

參考álvarez等人的方法［15］，利用流變儀在小幅振蕩模式下測定乳化肉糜的動態彈性模量(G')變化。具體實驗參數是:使用直徑為2 cm的平板夾具，對肉糜樣品進行溫度掃描，以2℃/min的速率從20℃升至80℃，最大應變為0.02，頻率為5 Hz，樣品厚度為1 mm。最后，在樣品和夾具邊緣滴加硅油，以便防止樣品的水分蒸發，并在夾具外面扣上保護蓋。

1.3.6 蒸煮得率

乳化香腸用膠原蛋白腸衣灌腸后(每隔10 cm用棉線打結為一根)編號稱重，蒸煮冷卻后再次按各編號分別稱重。每組樣品重復測定10根取平均值。

蒸煮得率/%=(香腸經蒸煮后的質量/蒸煮之前香腸的質量)×100

1.3.7 全質構分析(TPA)

乳化香腸剝去腸衣，切成2 cm高的圓柱體。使用質構儀進行TPA分析，設定的主要參數是:探頭類型:P/36R;測前速度:3.0 mm/s;測定速度:3.0 mm/s;測后速度:5.0 mm/s;壓縮比:60%。每個樣品做10次平行，取平均值。記錄硬度、黏聚性和咀嚼性的測定結果。

1.3.8 微觀結構

參考Plucknett等人［16］的方法，利用XL-30 ESEM環境掃描電鏡(ESEM)觀察乳化香腸的微觀結構。從香腸內部切出一小片厚度約為3 mm的樣品，用電鏡專用雙面膠粘貼在ESEM的圓形樣品臺上，再放入ESEM樣品室中，先抽真空再加壓。測試條件為:加速電壓20 kV，恒壓0.7 Torr，樣品室溫度8℃，放大倍數為800倍。樣品觀察時間控制在5 min以內，以避免長時間暴露導致樣品失水。

1.3.9 數據處理與統計分析

本實驗數據如無特別說明，均為2次重復3次平行獲得的平均值，使用origin 8.5作圖。使用Statistix 9的一般線性程序進行方差分析，采用最小顯著差數法(LSD)對數據進行顯著性統計分析(P＜0.05)。

2 結果與討論

2.1 不同類型SPI對乳化肉糜彈性模量的影響

分別添加了SPI可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體的乳化肉糜，其彈性模量(G')隨溫度升高的變化如圖1所示。

圖1 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體對乳化肉糜彈性模量的影響Fig.1 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the elastic modulus of meat emulsion

在20～40℃內，所有肉糜樣品的G'值呈現出下降的趨勢，這可能是因為溫度升高時，樣品內部蛋白之間的氫鍵作用逐漸被破壞。所有樣品的G'值再上升至50℃達到峰值，下降到60℃達到最低值后，G'值迅速增加，表明肉糜狀態由黏性溶膠向彈性凝膠網絡轉變。乳化肉糜的這種流變性質模式與已經報道的肌纖維蛋白凝膠和乳化型凝膠相吻合［15，17-18］。與未添加任何SPI的空白肉糜相比，添加SPI的不溶性聚集體和混合可溶/不溶性聚集體都很顯著地提高了肉糜的彈性模量(P＜0.05)，而單獨添加SPI的可溶性聚集體對肉糜沒有明顯的影響。添加未變性native SPI肉糜的G'值低于未添加SPI的空白肉糜，這一結果與native SPI在肌肉蛋白中的負面效果一致。添加SPI酶解物也顯著破壞了肉糜的凝膠網絡形成。

2.2 不同類型SPI對乳化香腸蒸煮得率的影響

如圖2所示，與空白香腸相比，添加不同類型的SPI(native，酶解物和聚集體)都顯著提高了香腸的蒸煮得率。其中，含有SPI不溶性聚集體的香腸蒸煮得率最高，比不添加任何SPI的空白香腸蒸煮得率高了4%(P＜0.05)。這可能是因為不溶性聚集體的添加起到一定的空間填充效應，使香腸結構變得更致密，空隙變少，提高了連續相中的有效蛋白濃度，從而增強了蛋白的保水量［19］。此外，這種由不溶性聚集體誘導形成的香腸致密結構也可能起到一定的鎖水作用，在蒸煮過程中對香腸內部的水分蒸發起到物理阻礙的屏障效應。另外，SPI的酶解物也提高了香腸的蒸煮得率，這是因為有限水解能夠促使大豆蛋白的天然緊湊結構解離，形成亞基和帶電極性基團(NH3+，

COO-)，從而增強蛋白的束水能力［6，11］。

圖2 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體對乳化香腸蒸煮得率的影響Fig.2 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the cooking yield of emulsified sausage

2.3 不同類型SPI對乳化香腸質構的影響

添加不同類型SPI對香腸質構的影響如表2所示。與不添加任何SPI的空白香腸相比，添加SPI不溶性聚集體的香腸硬度、黏聚性和咀嚼性均顯著提高(P＜0.05)。添加SPI可溶性聚集體和native SPI對香腸質構都沒有明顯影響，但SPI水解物則顯著破壞了香腸的質構。結合香腸的微觀結構可以看出，SPI的不溶性聚集體至少部分以“填充物”的形式分布在香腸的蛋白網絡結構中，香腸結構緊密，并改善了香腸的質構。SPI不溶性聚集體的這種“填充物”效應提高香腸質構的情況類似于脂肪球增強肌肉蛋白凝膠強度［19］。

值得一提的是，Feng等人曾經報道添加SPI的Alcalase水解物(DH4)顯著提高了乳化香腸的質構［6］，而本研究卻發現，SPI經Alcalase水解后顯著削弱了香腸的質構。分析產生2種截然相反結果的原因，很有可能是源自二者添加的SPI水解物成分的極大差異。Feng等人是將SPI的水解物全部添加到香腸中，其中包括經水解產生的可溶部分的多肽段和發生疏水聚集的不溶性沉淀;而本研究是將SPI的水解物離心后，僅取其可溶部分添加到香腸中。該可溶性的多肽段很可能破壞瓦解肌肉蛋白凝膠網絡的形成，從而在宏觀上表現出質構比不添加任何SPI的空白香腸差。同時，根據該SPI水解物組分差異引起的相反結果，似乎也可以從側面幫助推測出SPI的不溶性聚集體或沉淀物具有改善香腸質構的有利作用。

表2 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體對乳化香腸質構的影響Table 2 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the texture of emulsified sausage

2.4 不同類型SPI對乳化香腸微觀結構的影響

利用環境掃描電鏡(ESEM)觀察了添加不同SPI對香腸微觀結構的影響，如圖3所示。與傳統掃描電鏡(SEM)相比，環境掃描電鏡無需干燥、噴金等前處理，可以直接觀察含水樣品在原始狀態下的微觀結構，比如 β-乳球蛋白［20］、明膠/糊精混合凝膠［21］。從圖3可以看出，未添加任何SPI的香腸呈現出具有纖維狀、棒狀、多孔的網絡結構，這與Feng等人使用普通掃描電鏡(SEM)觀察到的空白香腸結構一致［6］。添加native SPI的香腸結構較粗糙、空隙較大。添加SPI水解物的香腸看上去比較松散細碎，缺少了連續的繩狀交聯網絡結構，這可能是因為SPI經水解后形成的小分子多肽段干擾了肌肉蛋白相互間的交聯反應。添加SPI的可溶性聚集體后，可以看到香腸的凝膠網絡結構密度增強，空隙變小。而添加的SPI不溶性聚集體似乎像填充物一樣，使得香腸結構更連續緊實，空隙較少，這種更緊密的交互式結構很可能有利于提高香腸蒸煮得率和質構。

圖3 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體對乳化香腸微觀結構的影響(ESEM，放大倍數800)Fig.3 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the microstructure of emulsified sausage(ESEM，magnification:×800)

3 結論

與不添加任何SPI的空白香腸相比，添加native SPI、SPI的可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體均顯著提高了乳化香腸的蒸煮得率。native SPI較明顯地降低了肉糜的彈性模量，但對香腸的質構沒有明顯影響;SPI的可溶性水解物顯著地破壞了香腸的質構和凝膠網絡結構;SPI的可溶性聚集體對乳化肉糜的彈性模量和香腸質構沒有明顯影響，但在一定程度上改善了香腸的微觀結構;SPI的不溶性聚集體很顯著地提高了肉糜彈性模量和香腸質構，并誘導形成了較連續緊密的香腸結構。本研究結果說明了商業SPI中的不溶性聚集體部分對香腸品質的改善作用，對乳化香腸用商業SPI的生產具有一定的指導意義。

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