香蕉皮單寧的提取及其提取物的抑菌抗氧化活性*

王虹玲，武婷茹，姜詩文，劉丹丹，司銳，楊玉紅

(沈陽工學院生命工程學院，遼寧撫順，113122)

香蕉為我國南方四大果品之一，屬于高熱量水果，營養價值頗高，且產量很大。長期以來，對于香蕉人們只食其果肉，而對于果皮未有充分的開發利用。研究表明，香蕉皮占香蕉全果重量的35% ～41%［1］，其中含有大量的果膠、膳食纖維、蛋白質、脂肪及多種微量元素［2］;此外，香蕉皮中含有的活性抑菌成分——單寧還可有效地治療由細菌和真菌感染所引起的皮膚瘙癢癥［3］。因此充分開發香蕉皮資源，既可以實現資源的循環利用，保護環境，又可以創造額外的經濟價值。目前對于香蕉皮中果膠［4-7］、多糖［8-9］、膳食纖維［10-12］等營養物質提取的研究較多，但是對于單寧的提取卻鮮有報道。

單寧又稱鞣質、單寧酸，是多酚中高度聚合的化合物，化學性質活潑。研究表明單寧在紫外線區有強吸收值，能高效吸收空氣中的紫外線，抑制過氧化氫酶的活性，還原皮膚中沉積的黑色素從而起到防曬美白的效果［13］;此外，單寧還可以通過抑制皮膚中彈性蛋白酶對彈性蛋白的降解能力恢復皮膚彈性，延緩機體衰老，促進細胞代謝，增強皮膚活力，起到抗皺的功能［14］。近年來又因其具有抗氧化、捕捉自由基、抑菌、衍生化反應等生物活性，而被廣泛地應用于食品加工、果蔬加工、貯藏、醫藥和水處理等領域［15］，開發前景十分廣闊。

本研究以市售新鮮香蕉為原料，通過響應面分析法優化香蕉皮單寧的微波提取工藝條件，并對單寧提取物進行了抑菌和抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 材料

市售進口香蕉，購于撫順市農貿市場。

1.1.2 供試菌種

細菌為大腸桿菌，金黃色葡萄球菌;霉菌為根霉菌，青霉菌;酵母菌為啤酒酵母，以上菌種均為本實驗室保存菌種。

1.1.3 培養基

細菌、霉菌、酵母菌分別采用LB、PDA和YPD培養基培養。

1.2 試驗試劑

無水乙醇、丙酮、甲醇、H3PO4、HCl、H3PO4·12MoO3、Na2WO4、單寧酸、H2O2、Fe2SO4、FeCl3、Tris-HCl緩沖液、鄰苯三酚、鄰二氮菲、HCl等，均為國產或進口分析純。

1.3 儀器設備

LD210-2R型電子天平(美國 Sartorius公司)，721G型可見分光光度計(日本島津公司)，SW-CJ-2FD型超凈工作臺(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)，WF-2000微波提取器(上海寧商超聲儀器有限公司)，FW100型高速萬能粉碎機(成都廣譜科學儀器有限公司)，GFL-70型鼓風干燥箱(上海越眾儀器設備有限公司)，LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(杭州科博儀器有限公司)，HPX-9052MBE型電熱恒溫培養箱(蘇州江東精密儀器有限公司)，RE-52A型旋轉蒸發儀(上海洪紀儀器設備有限公司)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品預處理

將新鮮香蕉皮清洗去雜后放入鼓風干燥箱中，105℃殺青滅酶處理15min，然后在65℃條件下恒溫烘干至恒重，最后將干燥后的香蕉皮放入高速萬能粉碎機中粉碎，過40目篩，收集香蕉皮粉密封備用。

1.4.2 項目測定

1.4.2.1 F-D 試劑的配制［16］

F-D試劑配制:準確稱取 Na2WO4100 g、H3PO4·12MoO320 g、H3PO450 mL，溶于 750 mL 蒸餾水中，水浴回流2 h，待溶液冷卻后加蒸餾水稀釋至1 L備用。

1.4.2.2 單寧酸標準曲線的繪制

稱取單寧酸5 mg，加水溶解并定容至50 mL，得到濃度為0.1 mg/mL的單寧酸標準液。準確吸取標準液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 和 4.5 mL于10個50mL容量瓶中，分別加入2.5 mL F-D試劑和5 mL飽和碳Na2CO3溶液，定容且混合均勻，靜置30 min后以第一個容量瓶中的溶液為空白對照，于650 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(Y)，濃度(μg/mg)為橫坐標(X)，得到的標準曲線方程:Y=0.089 8 X-0.002 1;R2=0.999 7。

1.4.2.3 單寧的提取及含量測定［17］

將處理后的香蕉皮粉準確稱取1.0 g置于錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇提取溶劑，于一定微波功率和料液比條件下，在微波提取器中提取一定時間，反復提取3次，合并濾液，與標準曲線同法測吸光度，并根據標準曲線計算單寧提取量。

1.4.2.4 單寧總含量的測定及提取率計算

準確稱取香蕉皮粉1.0 g，在乙醇體積分數70%、提取時間100 s、微波功率450 W、料液比1∶30(g∶mL)的條件下，進行反復提取，直到濾渣中加入1%的FeCl3不顯綠色為止，分別計算出每次提取的單寧含量，并進行疊加，得出香蕉皮中單寧的總含量。通過測定香蕉皮中單寧的總含量為439.73 mg/g。

單寧提取率/%=(單寧提取量/單寧總含量)×100

1.4.3 響應面試驗

根據單因素試驗結果和Central Composite Design(CCD)設計原理，運用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計，以單寧提取率為響應值，乙醇體積分數、提取時間、微波功率及料液比為考察因素，建立響應值與影響因素間的數學模型，優化香蕉皮單寧的最佳提取工藝。試驗設計因素和水平見表1。

1.4.4 單寧抑菌效果測定

1.4.4.1 菌懸液的制備

將預先制備好的培養基滅菌后置于平皿內，待培養基凝固后接入相應菌種，細菌于37℃下恒溫培養1 d，霉菌和酵母菌于28℃下恒溫培養2 d，連續培養3次，取活化好的菌種用無菌生理鹽水配制成濃度為108CFU/mL的菌懸液，備用。

1.4.4.2 抑菌性能的測定［18］

將濾紙用打孔器打成直徑為6 mm的濾紙片，160℃干熱滅菌2 h后放入單寧提取液中浸泡24 h，無菌水做對照。吸取制備好的菌懸液100 μL于相應的培養皿上，均勻涂布。用無菌鑷子將上述濾紙片瀝去多余液體后放入含菌平皿中，每皿2片，每種菌做3個重復，按相應條件培養。游標卡尺分別測量每個抑菌圈的兩個垂直方向的直徑(呈十字)，取平均值，判定其抑菌效果。

1.4.4.3 最低抑菌濃度(MIC)的測定［19］

將提取液濃縮后，配制濃度為50 mg/mL的溶液，依次倍比稀釋得到8個濃度梯度的單寧溶液，各吸取2 mL置于平板內，之后加入預先制備好的培養基，充分混勻待其凝固后，吸取100 μL菌懸液于平板內，涂布均勻，放入相應條件下的恒溫培養箱內培養一定時間，菌落生長被完全抑制的最低藥物濃度為提取液對該菌的MIC。每個受試樣平行重復3次，以不含提取液的平板做對照。

1.4.4.4 防腐劑對照

將8個濃度的單寧溶液換成同樣濃度的苯甲酸鈉溶液且做相同處理，測定常用化學防腐劑苯甲酸鈉對各菌種的MIC。

1.4.5 單寧抗氧化活性試驗

1.4.5.1 香蕉皮單寧對超氧陰離子自由基的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法［20］測定香蕉皮單寧對超氧陰離子自由基的清除作用。準確吸取不同濃度的待測樣品液1mL，加入4.5 mL 0.1 mol/L的Tris-HCL緩沖液(pH 8.2)和0.3 mL于25℃條件下預熱的5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃條件下保溫5 min，加10 mol/L的HCl溶液1 mL終止反應，320 nm波長處測定吸光值，記為Ai，空白對照以相同體積的去離子水代替樣品，記為A0，每組試驗重復3次，取平均值。以VC做陽性對照，同法操作。清除率計算公式為:

P/%=［(A0-Ai)/A0］×100

1.4.5.2 香蕉皮單寧對羥自由基的清除作用［21］

取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL，PBS緩沖液5 mL，0.75 mmol/L FeSO4溶液1 mL和2 mL不同濃度的樣品溶液充分混勻后，加入1 mL 3%H2O2，于37℃水浴中反應60 min后，在536 nm處測定吸光度值，做3次平行試驗，取平均值。以VC做陽性對照，同法操作。清除率(P)計算公式為:

P/%=［(A2-A0)/(A1-A0)］×100

式中:A0為不含樣品的溶液的吸光值;A1為以蒸餾水代替H2O2的溶液的吸光值;A2為含有樣品的溶液的吸光值。

2 結果與討論

2.1 響應面分析法優化香蕉皮單寧提取工藝

2.1.1 回歸模型的建立及方差分析

根據單因素試驗結果，選取單寧提取率為考察響應值，進行乙醇體積分數(A)、提取時間(B)、微波功率(C)和料液比(D)4因素5水平的Central Composite Design(CCD)試驗設計。響應面分析方案與結果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，獲得以香蕉皮單寧提取率為響應值的回歸方程:Y=87.41-1.70A+0.065B+0.73C+0.35D+0.35AB+0.21AC+1.39AD+2.63BC-2.29BD+0.52CD-1.54A2-5.12B2-1.59C2-2.52D2。

回歸方程的方差分析結果顯示(表3):回歸模型極顯著(P＜0.000 1)，失擬項不顯著(P＞0.05)，回歸模型的決定系數R2=0.970 1，調整系數，說明該模型與試驗擬合較好，可以用于香蕉皮中單寧提取率的理論預測。從回歸方程系數顯著性檢驗可知，各因素對單寧提取率影響程度依次為:乙醇體積分數＞微波功率＞料液比＞提取時間;交互項AD、BC、BD 極顯著(P ＜0.001);二次項 A2、B2、C2、D2均對單寧提取率有極顯著的影響(P＜0.000 1)。

表2 響應面分析方案及試驗結果Table 2 Program and experimental results of RSM

表3 回歸模型的方差分析結果Table 3 ANOVA results of regression model

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 Pro＞F 顯著性CD 4.27 1 4.27 1.82 0.197 5 A2 65.04 1 65.04 27.67 ＜0.000 1 ＊＊B2 719.70 1 719.70 306.14 ＜0.000 1 ＊＊C2 69.55 1 69.55 29.59 ＜0.000 1 ＊＊D2 174.86 1 174.86 74.38 ＜0.000 1 ＊＊殘差 35.26 15 2.35失擬項 24.26 10 2.43 1.10 0.487 0純誤差 11.01 5 2.20總和1 181.28 29

2.1.2 響應面分析及最佳提取工藝研究

香蕉皮單寧提取工藝優化的響應面及其等高線見圖1。圖1列出了自變量中交互作用極顯著(P＜0.01)的3項AD、BC和BD。3組圖形直觀的反應了各因素對響應值的影響，在響應面圖中，曲面越陡峭，則表示該因素對響應值的影響越顯著。等高線圖與響應面圖相對應，越接近等高線圖的中心，對應的響應值就越大，且等高線圖形狀接近橢圓形，表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。比較3組圖形可知，乙醇體積分數和微波功率對香蕉皮單寧提取率影響較為顯著，表現為曲線較陡峭;而提取時間和料液比次之，曲線較為平緩。同時，3組圖形的交互作用也都是明顯的，等高線趨于橢圓形。

圖1 各因素交互效應對香蕉皮單寧提取率影響的曲面圖Fig.1 Contour and surface plot of the combined effects of each factors on the tannin extraction from banana peel

圖1-a表示乙醇體積分數和料液比及兩者交互作用對香蕉皮單寧提取率的影響。從圖1-a可以看出，當料液比保持不變時，乙醇體積分數過高不利用單寧的提取;當保持乙醇體積分數不變時，單寧提取率隨料液比的提高呈現出先增加后降低的趨勢。

圖1-b為微波功率和提取時間及兩者交互作用對單寧提取率的影響。當微波功率不變時，隨提取時間的增大，香蕉皮單寧提取率先增大后減小;當提取時間不變時，隨微波功率的增加，單寧提取率逐漸增大。

圖1-c為料液比和提取時間的交互作用對香蕉皮單寧提取率的影響，從圖1-c中等高線變化趨勢可以隨著料液比和提取時間的提高，單寧提取率呈現先升高后降低的明顯趨勢。

運用Design Expert 8.0.6的響應面分析軟件對試驗結果進行優化，得到香蕉皮單寧的最優提取條件:當乙醇濃度為74.29%、提取時間為80.67 s、微波功率372.88 W、料液比為1∶29.53、提取次數為3次時，香蕉皮單寧提取率預測可達到最大值87.97%。為實際操作方便，將上述最優提取條件簡化為:乙醇體積分數75%、提取時間80 s、微波功率375 W、料液比1∶30，提取次數3次后進行3次重復試驗，得到香蕉皮單寧提取率的平均值為87.04%，與預測值接近，說明了此響應面法優化得到的單寧的微波提取工藝在實踐中可行。

2.2 抑菌性能測定

2.2.1 香蕉皮單寧的抑菌性能測定

通過問卷調查數據結果分析發現，北方農村住宅的取暖方式仍舊較為落后，使用傳統能源比例較大，是冬季室內空氣污染的主要來源；同時居民吸煙、房屋裝修、冬季結霜等也成為了室內污染的重要來源。居民通風換氣的次數低，主要依靠開窗通風的形式，單次開窗通風時間長，造成能源浪費，同時將室外污染物帶入室內，從數據可以看出，北方農村地區通風換氣現狀并不理想，存在很大的改善空間。居民對于室內環境的不滿意度較低，反映了居民對室內環境的關注程度較低，主動采取通風換氣措施來改善居住環境的意識較差。

圖2 香蕉皮單寧的抑菌試驗結果Fig.2 Antibacterial activities of tannin from banana peel

本試驗以細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)、真菌(酵母菌)和霉菌(青霉、根霉)為研究對象，考察了不同濃度香蕉皮單寧的抑菌性能，結果如圖2所示。單寧濃度為0是空白對照，即培養基中不含單寧提取液，涂布等量的無菌水?？瞻捉M抑菌圈直徑為6 mm，表示無抑菌效果，大于6 mm表示具有抑菌活性，抑菌圈直徑越大，抑菌效果越明顯。由圖2可知，香蕉皮單寧對各種以上各種微生物均有明顯的抑制作用，隨著單寧濃度的降低，相應的抑菌圈直徑也隨之減小。其中，單寧對大腸桿菌的抑菌的抑菌效果最明顯，對酵母菌的抑菌效果最差。表現出對于同一濃度的單寧提取液，大腸桿菌的抑菌圈直徑最大，酵母菌最小。當單寧濃度較高時(＞25 mg/mL)，金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于霉菌，濃度較低時則對霉菌的抑制效果較好。

2.2.2 香蕉皮單寧最低抑菌濃度MIC的測定

采用稀釋分析法分析香蕉皮單寧對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉、根霉和酵母菌的最低抑菌濃度(表4)，凡是最高稀釋平板中無菌落形成者，即為單寧對該菌種的MIC。由實驗結果可知，大腸桿菌的MIC為0.781 3 mg/mL，金黃色葡萄球菌和酵母菌為6.25 mg/mL，青霉和根霉為1.562 5 mg/mL，可見香蕉皮單寧對大腸桿菌的抑菌效果最好，酵母菌最差。這與濾紙片法進行香蕉皮單寧對各菌種的抑菌性能測定的結果相一致。

表4 香蕉皮單寧的最低抑菌濃度(MIC)Table 5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of tannin from banana peel

2.2.3 苯甲酸鈉MIC的測定

苯甲酸鈉是食品中常用的化學防腐劑，測定不同濃度的苯甲酸鈉對各種微生物的MIC，與香蕉皮單寧做對比，以此判定香蕉皮單寧替代化學防腐劑的可行性。苯甲酸鈉對5種受試菌的抑菌情況見表5。由5可知，苯甲酸鈉對各菌種均有不同程度抑菌作用，其中大腸桿菌的MIC為12.5 mg/mL，金黃色葡萄球菌為25 mg/mL，青霉和根霉為6.25 mg/mL，酵母菌的MIC為3.125 mg/mL?？梢姳郊姿徕c對酵母菌的抑制作用最明顯，對細菌的抑制作用最弱，其次為霉菌。比較香蕉皮單寧和苯甲酸鈉的對各菌種的MIC可知，與當前常用的化學防腐劑苯甲酸鈉相比，香蕉皮單寧提取液對以上五種受試菌具有較強的生長抑制作用。鑒于化學防腐劑的毒副作用，和我國香蕉資源的豐富，開發天然的防腐劑用以替代化學防腐劑在食品中的應用具有廣闊的應用前景。

表5 苯甲酸鈉的最低抑菌濃度(MIC)Table 5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of Sodium benzoate

2.3 香蕉皮單寧的抗氧化作用

2.3.1 香蕉皮單寧對超氧陰離子自由基的清除作用

通過圖3顯示，香蕉皮單寧提取物和Vc溶液均對超氧陰離子自由基有一定的清除能力，且清除率隨濃度的增加而提高。低濃度時Vc對超氧陰離子自由基的清除效果低于單寧，但隨濃度的增加至1.0 mg/mL后，Vc的清除效果急劇增加，在濃度為1.8 mg/mL時，Vc的清除率可達(85.12±2.872)%，單寧的清除率為(66.04±3.926)%。而單寧在低濃度時增加較快，當達到一個最佳濃度后趨于平緩，清除率變化不大，其中單寧提取液的最佳作用濃度為1.4 mg/mL。

2.3.2 香蕉皮單寧對羥自由基的清除作用

圖3 不同濃度的抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.3 Scavenging capacities of antioxidants in different concentrations for superoxide anion free radicals

香蕉皮單寧和Vc對羥自由基的清除效果如圖4所示。從圖4可以看出，隨著單寧和Vc質量濃度的增加，兩者對羥自由基的清除率均呈上升趨勢。其中低濃度時(＜1.4 mg/mL)，單寧對羥自由基的清除效果要優于Vc，但隨著濃度的增加單寧清除率曲線趨于平緩，Vc對羥自由基清除率則隨濃度的增加而迅速提高。當達到最大實驗濃度1.8 mg/mL時，Vc的清除率為(92.23±3.172)%，單寧的清除率為(73.14±4.128)%。

圖4 不同濃度的抗氧化劑對羥自由基的清除效果Fig.4 Scavenging capacities of antioxidants in different concentrations for hydroxyl free radicals

綜上可知，香蕉皮單寧對超氧陰離子和羥自由基均具有較好的清除效果，表現出較強的抗氧化活性。超氧陰離子自由基和羥自由基是氧分子還原成水時產生的活性中間體，由于自由基中含未成對電子而具有高度的化學活性，可對生物體產生極大的損傷。單寧中的酚羥基可提供活潑的氫從而穩定自由基，進而終止自由基的鏈式反應［14］。從單寧的抗氧化結果中可以看出，單寧對超氧陰離子和羥自由基的清除具有一定的飽和效應，即隨濃度的增大，清除率趨于平緩，此結果與張縱圓和顧海峰等人的研究相一致［23-25］。這可能是由于單寧易氧化的特性，隨濃度的增加，單寧自氧化作用與抗氧化作用達到平衡，從而限制了其清除活性氧的能力。

3 結論

本研究在單因素試驗基礎上，采用CCD試驗設計及響應面分析，建立了香蕉皮單寧提取的二次多項回歸模型，確定單寧提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數75%、提取時間為80 s、微波功率375 W、料液比為1∶30、提取次數3次，在此條件下單寧的提取率為87.04%。

香蕉皮中的單寧具有一定的抑菌活性，且對大腸桿菌的抑制效果最為明顯，依次為霉菌和酵母菌。最低抑菌濃度試驗結果表明，大腸桿菌的MIC為0.781 3 mg/mL，金黃色葡萄球菌和酵母菌為6.25 mg/mL，青霉和根霉為1.562 5 mg/mL，與單寧抑菌活性試驗結果相一致。同時，通過與常用的化學防腐劑苯甲酸鈉的MIC對比可知，香蕉皮單寧在對細菌和霉菌的抑菌效果方面要優于苯甲酸鈉。

香蕉皮單寧還可以有效的清除超氧陰離子自由基和羥自由基，且在低濃度時表現出優于Vc的清除能力;在濃度為1.8 mg/mL時，單寧對超氧陰離子和羥自由基的清除率可達(66.04±3.926)%和(73.14±4.128)%，具有較強的抗氧化性能。

我國香蕉資源豐富，香蕉皮中單寧含量較高且具有較強的抑菌和抗氧化性能，有效的利用香蕉皮資源，充分發揮的單寧的抑菌和抗氧化功能，研制出天然的防腐劑和抗氧化劑，在資源緊缺和人們健康意識不斷提高的今天具有非常重要的研究意義和應用價值。

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