我國不同地域煙曲霉臨床分離株CSP基因型及對抗真菌藥物的敏感性分析

唐夢丹 鄭建峰 沈亮亮 姜淼 趙敬軍

我國不同地域煙曲霉臨床分離株CSP基因型及對抗真菌藥物的敏感性分析

唐夢丹 鄭建峰 沈亮亮 姜淼 趙敬軍

目的探討我國不同地域致病煙曲霉臨床分離株CSP基因型分布情況,以及不同地域、不同CSP基因型煙曲霉藥物敏感性有無差異。方法對福建、上海、河北及北京四地臨床分離到的112株煙曲霉分別通過形態學、溫度試驗及β微管蛋白分子生物學測序鑒定,再對煙曲霉進行CSP基因分型,同時用M38-A方法測定伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B對不同型別煙曲霉的最低抑菌濃度(MIC)。結果112株曲霉均鑒定為經典煙曲霉,共確定11個CSP基因型,其中t04A、t03、t01最多見,分別為32株、17株、24株。福建分離株以t10、t04A、t01最常見,上海分離株以t04A、t01最常見,河北分離株以t01、t03、t04A最常見,北京分離株以t02、t04A、t01和t03最常見,t25為1個新CSP基因分型,新基因型菌株的菌落形態、生長速度、最適生長溫度與其他菌株并無顯著差別。不同CSP基因型煙曲霉對抗真菌藥物敏感性差異無統計學意義,但福建地區分離株對伊曲康唑的MIC值低于其他三地的分離株。結論煙曲霉臨床株CSP基因型存在一定的地域特點,不同基因型的煙曲霉對抗真菌藥物的敏感性差異無統計學意義,而不同地域來源煙曲霉對伊曲康唑敏感性存在差異。

曲霉菌,煙;微管蛋白;基因型

煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是侵襲性曲霉病最主要的致病菌。煙曲霉復合體包含25個不同種的菌,其中8個無性型,17個有性型。一些新的菌種如A.lentulus、A.udagawae、Neorsartorya fischeri、N.pseudofischeri也可以致病［1］,但其菌落形態及鏡下形態都與經典煙曲霉極為相似,往往不容易區分,因此,正確的菌種鑒定依賴于溫度試驗及分子生物學手段。不同煙曲霉復合體分支最高生長溫度不同,經典煙曲霉最高生長溫度為48℃以上,而A.lentulus、A.udagawae最高生長溫度分別為45℃和42℃［2］。不同分支的煙曲霉對抗真菌藥物的敏感性不同,有些菌株如A.lentulus、A.udagawae已開始出現耐藥［3］。CSP分型是目前可以用于經典煙曲霉的國際標準化命名體系,已經在國內外得到公認。CSP基因分型是對煙曲霉細胞表面蛋白(cell surface protein)編碼基因進行擴增測序,利用其編碼區域內的串聯重復序列多態性進行分型［4-7］。本研究旨在對福建、上海、河北及北京四地臨床分離的煙曲霉進行形態學、溫度試驗及分子生物學鑒定,再對煙曲霉進行CSP基因分型,同時用M38-A方法測定伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B對不同型別煙曲霉的最低抑菌濃度(MIC),以探討不同地區煙曲霉CSP型別的分布特點、不同基因型煙曲霉與抗真菌藥敏感性的關系,同時探討不同地區煙曲霉對抗真菌藥物的敏感性是否存在差異。

對象與方法

一、菌株來源

本研究收集了112株不同地域臨床分離到的煙曲霉,分別來自于北京(28株)、上海(24株)、福建(34株)及河北(26株)。其中104株分離于痰液,4株分離于鼻旁竇,另外皮膚、角膜、膿性分泌物及膽汁各分離到1株。

二、方法

1.形態學鑒定:把菌株點植在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)37℃培養3～7 d,每日觀察并記錄菌株生長情況,包括菌落大小、顏色、形狀、生長速度和質地,同時行KOH和乳酸酚棉藍染色觀察鏡下孢子形態,頂囊范圍、層數等。

2.溫度生長試驗:將鑒定出的煙曲霉菌株分別置于25℃、37℃和48℃恒溫培養箱中培養3～7 d,觀察菌落是否生長。

3.分子生物學試驗:采用玻璃珠法提取煙曲霉基因組DNA［8］。對β微管蛋白進行PCR擴增后,取40 μl PCR產物及上游引物送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行單向測序,測序結果在Genbank上用BLAST軟件進行比對。

4.CSP基因分型:對鑒定出的經典煙曲霉進行CSP基因擴增測序后［4］,在其堿基序列中使用Microsoft Word的查找與替代功能尋找重復單位,明確其連接順序,并利用mega5.0軟件查找其重復區域上游第 1、14、15及下游第 1、2、3密碼子突變類型,根據國際標準化分型命名進行分型［4］。

5.藥物敏感性試驗:參照2003年美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)制定的產孢絲狀真菌抗真菌藥物敏感性試驗方案M38-A進行［9］。以煙曲霉ATCC204305、近平滑念珠菌ATCC22019作為質控菌株,測定臨床分離到的煙曲霉對伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B的MIC。每次試驗時同時進行標準株的敏感性測定,每次結果顯示其MIC總介于同一范圍、且各藥物每次測定的MIC波動不超過1個稀釋度方認為試驗操作無誤。

6.統計學方法:采用SPSS 20.0統計軟件包對不同CSP型別、不同地區煙曲霉的MIC進行Kruskal-Wallis秩和檢驗。

結 果

一、曲霉的形態學及測序鑒定結果

112株曲霉經培養及乳酸酚棉藍染色后鏡下觀察,均為煙曲霉;112株煙曲霉在48℃時均能生長,支持為經典煙曲霉;通過β微管蛋白序列鑒定,均能將曲霉鑒定到種,與Genbank中經典煙曲霉序列比對,呈現98%以上一致性,證實均為經典煙曲霉。

二、煙曲霉的CSP基因分型結果

對4個地區的煙曲霉臨床分離株進行CSP分型,共分為11型。其中t25基因型為新CSP分型,此煙曲霉來自福建,分離自膿液。t04A、t03和t01為最常見3種基因型,其中福建分離株以t10、t04A、t01為常見,上海分離株以t04A、t01為常見,河北分離株以t01、t03、t04A 為常見,北京分離株以 t02、t04A、t01和t03為常見,另外t02主要分離自河北、北京,而t10主要分離自福建(表1)。對新發現的t25型菌株進行研究發現,其菌落形態、生長速度、最適生長溫度與其他菌株并無顯著差別。

三、不同基因型及不同地區煙曲霉臨床分離株藥敏試驗結果

112株煙曲霉分離株的MIC范圍見表2,伏立康唑為0.125～1 mg/L,伊曲康唑為0.125～2 mg/L,兩性霉素B為0.125～4 mg/L。7種基因型的煙曲霉對伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B的敏感性差異無統計學意義(均P＞0.05)。t06A、t17、t18B因只有2株,t25只有1株,未進行統計學比較。福建分離株對伊曲康唑的敏感性最高,與上海、河北及北京的分離株比較差異有統計學意義(P＜0.05);而4個地區菌株對伏立康唑、兩性霉素B的敏感性差異無統計學意義(均P＞0.05)。

表2 3種抗真菌藥對不同地域及不同基因型煙曲霉的最低抑菌濃度(MIC)范圍(mg/L)

討 論

曲霉的準確鑒定和分型是曲霉屬系統發生學的基礎,同時對曲霉感染的實驗室診斷和流行病學調查具有重要意義。煙曲霉不同分支的菌落和鏡下形態特征極為相似,僅憑形態學往往難以區分。研究顯示,利用β微管蛋白基因(β-tubulin)、鈣調蛋白基因、Rodlet A的序列分析可以將曲霉鑒定到種［10］。煙曲霉不同分支對抗真菌藥物的敏感性不同,有臨床研究發現,煙曲霉復合體的一些菌株對唑類和兩性霉素B等抗真菌藥物出現了耐藥［11-12］。因此,在臨床工作中,準確鑒定煙曲霉相關菌株,對于指導抗真菌藥物的選擇,改善患者預后具有重要意義。我們對北京、上海、福建及河北多家醫院臨床分離到的112株煙曲霉進行形態學、溫度試驗及β微管蛋白序列分析,證實我們收集的臨床分離株均為經典煙曲霉,且未發現這些菌株常見生物學性狀的差異,與李若瑜等［7］研究結果一致。

CSP基因多態性在于其編碼區內重復單位不同的順序和數目變化及重復區域兩側的點突變。雖然有相關研究表明,CSP基因分型的分辨率不如微衛星序列分型,但其有簡便、快速、無需特殊軟件處理等優勢［5］。 最早 Klaassen 等［6］對荷蘭不同醫院分離到的209株煙曲霉進行CSP基因分型,發現了19個基因型。同年Kidd等［4］對澳大利亞的164株煙曲霉進行CSP分型增補至22個基因型。李若瑜等［7］對北京大學真菌病研究中心保存分離自125例患者的162株煙曲霉臨床株進行CSP分型,分為16型,且發現了5個新的基因型,使CSP基因型分型增至27個。本研究中對4個地區臨床分離到的112株經典煙曲霉進行CSP分型,分為11型,其中1個為新型t25。通過對發現的新基因型菌株進行生物學特性研究,發現其菌落形態、生長速度、最適生長溫度與其他菌株并無顯著差別。另外t02主要分離自河北、北京,而t10主要來自福建,而且從福建分離到的煙曲霉中發現有12株t10型,t10占福建總株數的35.29%,這些結果在一定程度上提示,不同地區可能存在不同的流行菌株。如果我們從更多地區分離更多煙曲霉菌株進行深入研究,將可以更好地反映我國境內煙曲霉菌株CSP分型及其分布情況。另外致病菌株與環境菌株的關系國外也有研究報道,Leenders等［13］對荷蘭鹿特丹大學醫院院內和周圍環境中的煙曲霉分布進行了長達14個月的研究,證實血液病病房致病煙曲霉菌株與環境中持續存在達1年以上的菌株有關。后續研究我們有必要收集多家醫院院內和周圍環境空氣中的煙曲霉進行CSP基因分型比較研究。

我們在進行煙曲霉的藥物敏感性測定中,判定點采用兩性霉素B MIC＞8 mg/L,唑類藥物MIC＞2 mg/L即為耐藥［14］。我們對不同CSP型別的煙曲霉菌株進行比較,未發現不同CSP類型煙曲霉對伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B敏感性存在統計學差異,而且新發現的t25菌株對這3種藥物不存在耐藥情況。同時通過對4地臨床分離到的煙曲霉MIC進行比較,發現以福建地區分離株對伊曲康唑的MIC最低,可能與不同地區臨床對唑類藥物的使用頻率、醫務人員使用伊曲康唑預防用藥有一定關系。

志謝北京大學第一醫院皮膚科,復旦大學附屬華山醫院皮膚科真菌室,河北醫科大學附屬第二醫院皮膚科,福建醫科大學附屬協和醫院檢驗科提供研究用煙曲霉

［1］Balajee SA，Gribskov J，Brandt M，et al.Mistaken identity:Neosartorya pseudofischeri and its anamorph masquerading asAspergillus fumigatus［J］.J Clin Microbiol，2005，43(12):5996-5999.

［2］Yaguchi T，Horie Y，Tanaka R，et al.Molecular phylogenetics of multiple genes onAspergillussectionFumigatiisolated from clinical specimens in Japan［J］.Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi，2007，48(1):37-46.

［3］Alcazar-Fuoli L，Mellado E，Alastruey-Izquierdo A，et al.AspergillussectionFumigati:antifungal susceptibility patterns and sequencebased identification［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(4):1244-1251.

［4］Kidd SE1，Nik Zulkepeli NA，Slavin MA，et al.Utility of a proposed CSP typing nomenclature for AustralianAspergillus fumigatusisolates:Identification of additional CSP types and suggested modifications［J］.J Microbiol Methods，2009，78(2):223-226.

［5］Balajee SA，de Valk HA，Lasker BA ，et al.Utility of a microsatellite assay for identifying clonally related outbreak isolates ofAspergillus fumigatus［J］.J Microbiol Methods，2008，73(3):252-256.

［6］Klaassen CH，de Valk HA，Blaljee SA，et al.Utiluty of CSP typing to sub-type clinicalAspergillus fumigatusisolates and proposal for a new CSP type nomenclature ［J］.J Microbiol Methods，2009，77(3):292-296.

［7］高露娟，余進，李若瑜.煙曲霉再鑒定、標準化CSP分型及體外藥物敏感性［J］.中國真菌學雜志，2011，6(6):328-331，336.

［8］Oh BH1，Song YC，Lee YW，et al.Comparison of nested PCR and RFLP for identification and classification of malassezia yeasts from healthy human skin［J］.Ann Dermatol，2009，21(4):352-357.

［9］National Committee for Clinical Laboratory Standards，2002.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi approved standard.NCCLS document M38-A ［J］.Clinicaland Laboratory Standards Institute，Villanova，Pa.

［10］Varga J，Houbraken J，Van Der Lee HA，et al.Aspergillus calidoustussp.nov.，causative agentofhuman infections previously assigned toAspergillus ustus［J］.Eukaryot Cell，2008，7(4):630-638.

［11］Burgel PR，Baixench MT，Amsellem M，et al.High prevalence of azole-resistantAspergillus fumigatusin adults with cystic fibrosis exposedto itraconazole［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(2):869-874.

［12］Colozza C，Posteraro B，Santilli S，et al.In vitroactivities of amphotericin B and AmBisome againstAspergillusisolates recovered from Italian patients treated for haematological malignancies［J］.Int J Antimicrob Agents，2012，39(5):440-443.

［13］Leenders AC，van Belkum A，Behrendt M，et al.Density and molecular epidemiology ofAspergillusin air and relationship to outbreaks ofAspergillusinfection［J］.J Clin Microbiol，1999,37(6):1752-1757.

［14］verweij PE，Howard SJ，Melchers WJ，et al.Azole-resistance inAspergillus:proposed nomenclature and breakpoints ［J］.Drug Resist Updat，2009，12(6):141-147.

CSP genotypes and antifungal susceptibility ofAspergillus fumigatusisolates from clinical settings in different regions of China

Tang Mengdan*，Zheng Jianfeng，Shen Liangliang，Jiang Miao，Zhao Jingjun.*Department of Dermatology，Tongji Hospital，Tongji University，Shanghai 200065，China

Zhao Jingjun，Email:zhaomyco@163.com

Objective To describe the CSP genotypic profile in clinical isolates ofAspergillus fumigatesfrom different regions of China，and to investigate if there is a difference in antifungal susceptibility amongA.fumigatesof different CSP genotypes and from different regions.Methods Totally，112A.fumigatesstrains clinically isolated from Fujian，Shanghai，Hebei and Beijing were included in this study，and identified according to macro-and micro-morphological characters，growth temperature and β-tubulin sequence.ClassicA.fumigatusstrains were typed according to CSP gene sequence.The minimal inhibitory concentrations(MICs)of voriconazole，itraconazole and amphotericin B toA.fumigateswere determined in accordance with the National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)M38-A protocol.Results All the strains were identified as classicA.fumigates，and fall into 11 CSP genotypes.The most common genotypes were t04A(n=32)，t03(n=17)and t01(n=24)in all the strains，t10，t04A and t01 in Fujian，t04A and t01 in Shanghai，t01，t03 and t04A in Hebei，t02，t04A，t01and t03 in Beijing.OneA.fumigatusstrain was identified as a new CSP type t25 in Fujian，which showed no obvious difference in morphology，growth rate or appropriate growth temperature from the other CSP genotypes ofA.fumigatusstrains.No statistical difference was found in the susceptibility to amphotericin B，itraconazole or fluconazole among different genotypes ofA.fumigates，whereas the MICs of itraconazole were significantly lower inA.fumigatesisolates from Fujian than in those from the other three regions.Conclusions The CSP genotypic profile ofA.fumigatesvaries in clinical isolates from different regions.No significant difference is observed in the susceptibility to amphotericin B，itraconazole or fluconazole among different CSP genotypes ofA.fumigates，but the susceptibility to itraconazole is somewhat different betweenA.fumigatesstrains from different regions.

Aspergillus fumigatus；Tubulin；Genotype

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.006

國家自然科學基金(81071329)

200065上海,同濟大學附屬同濟醫院皮膚科(唐夢丹、沈亮亮、姜淼、趙敬軍);福建醫科大學協和臨床醫學院(鄭建峰)

趙敬軍,Email:zhaomyco@163.com

2013-08-09)

(本文編輯:顏艷)