龍膽草對HaCaT細胞增殖和凋亡及表皮生長因子受體磷酸化的影響

婁銀飛 馬麗俐 鄭明警 周慧 方一妙

龍膽草對HaCaT細胞增殖和凋亡及表皮生長因子受體磷酸化的影響

婁銀飛 馬麗俐 鄭明警 周慧 方一妙

目的探討龍膽草提取物對表皮生長因子(EGF)刺激后HaCaT細胞增殖和凋亡及表皮生長因子受體(EGFR)磷酸化的影響。方法取0～50 g/L龍膽草提取物作用于EGF刺激后的HaCaT細胞24 h,噻唑藍法檢測細胞增殖率,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,Western印跡法檢測磷酸化EGFR。結果龍膽草提取物濃度依賴性地抑制EGF刺激后HaCaT細胞的增殖(r=-0.991,P＜0.01),促進EGF刺激后HaCaT細胞的凋亡(r=0.996,P＜0.05)。同時,龍膽草提取物使EGF刺激后的HaCaT細胞EGFR的磷酸化水平降低,該作用隨著藥物濃度的增加而增加。結論龍膽草可能通過降低EGFR的磷酸化,阻斷相關細胞內信號通路來抑制角質形成細胞的過度增殖并促進細胞的凋亡。

龍膽屬;角蛋白細胞;細胞增殖;細胞凋亡;受體,表皮生長因子

在臨床用藥中觀察到,以龍膽草為主藥的中藥復方制劑在改善銀屑病紅斑和鱗屑等皮損方面有效,同時有報道經典方劑龍膽瀉肝湯、當歸龍薈丸等對銀屑病皮損的改善療效顯著［1-2］,但對其作用機理研究未見深入。本實驗旨在通過觀察龍膽草提取物對HaCaT細胞增殖、凋亡及表皮生長因子受體(EGFR)磷酸化的影響,探討其治療銀屑病的作用機制。

一、材料

HaCaT細胞由浙江省中醫院中心實驗室保存提供,龍膽草經水煮醇沉法濃縮提取藥液,調pH至7.0,質量濃度為1 g/ml,1640培養液產自美國Hylcone公司,胎牛血清產自浙江天杭生物科技有限公司,重組人表皮細胞生長因子(rhEGF)產自北京Sino Biological Inc公司,磷酸化兔抗人EGFR多克隆抗體、兔抗β肌動蛋白多克隆IgG抗體及山羊抗兔IgG二抗產自美國Bioworld Technology Inc公司。

二、方法

1.細胞培養:37℃5%CO2條件下用含10%胎牛血清的1640培養液培養HaCaT細胞。

2.噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖:取對數生長期細胞,按104/孔接種于96孔平板培養24 h,換含20 μg/L EGF的培養液培養 24 h 后, 各孔分別加入 10、20、30、40、50 g/L 龍膽草提取物200 μl,每個濃度設5個復孔,同時設立空白對照組,繼續培養24 h。每孔加5 g/L MTT 20 μl,繼續培養4 h。離心,棄上清液,每孔加入100 μl二甲基亞砜(DMSO),振蕩,酶聯免疫檢測儀測定各孔490 nm處吸光度值(A490)。

3.流式細胞儀檢測細胞凋亡:取對數生長期細胞,105個/孔接種于6孔平板培養24 h,換含20 μg/L EGF培養液培養24 h。各孔分別加入10、30、50 g/L龍膽草提取物2 ml,設空白對照組,繼續培養4 h。收集細胞,離心。棄上清液,重懸細胞于結合緩沖液500 μl,調整細胞至106/ml,每個離心管加入膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素5 μl和碘化丙錠10 μl,室溫避光15 min,用流式細胞儀分析細胞凋亡。

4.Western印跡法檢測細胞磷酸化EGFR:取對數生長期細胞,待細胞長滿瓶底90%時,各瓶分別加入10、30、50 g/L龍膽草提取物5 ml,設空白對照組,培養24 h。20 μg/L EGF培養液作用10 min后棄上清液。每瓶加入含20%磷酸酶抑制劑的細胞裂解液150 ml,提取細胞總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。配制8%凝膠,每孔加入30 μg蛋白樣品,置電泳緩沖液中,常規電泳操作并轉膜、封閉,一抗、二抗室溫孵育,曝光。

5.統計學方法:應用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析,結果以±s表示,兩組比較采用雙側t檢驗,數據相關性采用Pearson相關分析法,P＜0.05為差異有統計學意義。

三、結果

1.龍膽草提取物對HaCaT細胞增殖的影響:10、20、30、40、50 g/L龍膽草提取物組的A值(0.960±0.016、0.831±0.007、0.379±0.009)與空白對照組A值(1.095)相比差異均有統計學意義(t值分別為 56.97、106.10、63.61、42.28、11.39,均P＜0.05,n=8)。龍膽草提取物在0～50 g/L范圍內濃度依賴性地抑制EGF刺激后HaCaT細胞的增殖,增殖率與濃度呈線性負相關(r=-0.991,P＜0.01)。

2.龍膽草提取物對EGF刺激后HaCaT細胞凋亡的影響:空白對照組及10、30、50 g/L龍膽草提取物組細胞凋亡率分別為2.1%、5.9%、20.7%、36.3%,見圖1。且細胞凋亡率與龍膽草提取物濃度呈正相關(r=0.996,P＜0.05)。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

3.龍膽草提取物對HaCaT細胞EGFR磷酸化的影響:龍膽草提取物在0～50 g/L范圍內,HaCaT細胞均有基礎量的磷酸化EGFR,隨著龍膽草提取物濃度的增加,EGFR磷酸化水平呈降低趨勢。見圖2。

圖2 龍膽草提取物對HaCaT細胞EGFR的磷酸化的影響

四、討論

EGFR被認為是在包括表皮角質形成細胞(KC)在內的多種細胞的增殖和凋亡過程中有著重要作用［3］。銀屑病的病理基礎主要在于KC增殖和凋亡異常,因此,研究增殖和凋亡及與其密切相關的細胞因子EGFR,對銀屑病的發生發展和治療轉歸有著重要的意義。EGFR是一種酪氨酸激酶型受體,廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞膜表面。當其與包括EGF在內的多種配體之一結合后進入細胞內,形成同源或異源二聚體,傳遞信號,激活相關信號通路,對細胞周期進行調控。在正常的皮膚損傷反應中,EGFR及其配體通過刺激增生和調節分化促進KC移動,參與急性傷口的愈合過程。它們持續過度的異常表達,導致細胞異常增殖、黏附,從而引起包括銀屑病、特應性皮炎等在內的多種慢性炎癥性皮膚病的發生［4］。EGFR在銀屑病進行期、靜止期皮損的基底層及棘層、顆粒層中均有較強表達,在正常皮膚和銀屑病消退期的表達明顯減少［5］。此外臨近正常皮膚的皮損也有較強表達［6］。說明EGFR的高表達與銀屑病的發生、發展關系密切［7］。阻斷EGFR能顯著提高KC在應激狀態(如傳代)時的凋亡率［8］。靛玉紅治療銀屑病有效,其治療機理為抑制EGFR的激活［9］。酪氨酸激酶抑制劑AG 1571(SU 5271)抑制EGFR的磷酸化,被認為是強有效的抗銀屑病藥物之一［10］。厄洛替尼(一種惡性腫瘤治療藥物)能抑制EGFR酪氨酸激酶抑制劑,有報道成功地治愈了2例肺癌合并銀屑病患者的皮膚疾病［11］。

我們通過EGF刺激HaCaT細胞,使其模擬銀屑病KC的異常增殖狀態,并通過MTT法及流式細胞儀檢測細胞的增殖及凋亡情況。結果顯示,在10～50 g/L濃度范圍內,龍膽草提取物能有效抑制HaCaT細胞的增殖。當濃度大于30 g/L時,抑制作用明顯。其抑制作用與濃度呈線性相關。上述實驗結果與流式細胞儀測得的細胞凋亡率結果相符。表明龍膽草抑制HaCaT細胞的增殖可能是通過促進細胞凋亡來完成的。進一步Western印跡法分析發現,龍膽草提取物能使EGFR的磷酸化降低,并且在0～50 g/L濃度范圍內隨著濃度的增加,EGFR的磷酸化水平降低。表明龍膽草提取物抑制HaCaT細胞增殖和促進凋亡的作用至少部分可能是通過降低EGFR的磷酸化從而阻斷相關細胞內信號通路來實現。50 g/L與30 g/L龍膽草提取物組EGFR的磷酸化水平相當,提示EGFR的磷酸化可能存在多條通路,而龍膽草提取物僅能干預其中部分通路的表達,具體機制有待后續研究。

［1］董亦秋.中醫藥治療銀屑病濕熱證用藥規律分析［J］.世界中醫藥，2013，8(4):453-455.

［2］王禾，王萍，張廣中，等.60例銀屑病患者中藥治療分析及血清總IgE、嗜酸細胞陽離子蛋白的變化［J］.中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2005，4(3):153-155.

［3］Oyama N，Sekimata M，Nihei Y，et al.Different growth properties in response to epidermal growth factor and interleukin-6 of primary keratinocytes derived from normal and psoriatic lesional skin［J］.J Dermatol Sci，1998，16(2):120-128.

［4］Mascia F，Mariani V，Girolomoni G，et al.Blockade of the EGF receptor induces a deranged chemokine expression in keratinocytes leading to enhanced skin inflammation［J］.Am J Pathol，2003，163(1):303-312.

［5］賈寶珍，郭書萍，劉露，等.尋常型銀屑病皮損中磷酸化STAT3 EGFR 的表達［J］.中國藥物與臨床，2008，8(3):206-207，插 2.

［6］郭靜，郝雁杰，張偉，等.尋常型進行期銀屑病皮損中VEGF、EGFR的表達及其與PASI指數的相關性研究［J］.皮膚病與性病，2013，35(1):7-10.

［7］Yoshida A，Kanno H，Watabe D，et al.The role of heparinbinding EGF-like growth factorand amphiregulin in the epidermal proliferation of psoriasis in cooperation with TNFalpha［J］.Arch Dermatol Res，2008，300(1):37-45.

［8］Rodeck U，Jost M，DuHadaway J，et al.Regulation of Bcl-xL expression in human keratinocytes by cell-substratum adhesion and the epidermal growth factor receptor［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1997，94(10):5067-5072.

［9］Hsieh WL，Lin YK，Tsai CN，et al.Indirubin，an acting component of indigo naturalis，inhibits EGFR activation and EGF-induced CDC25B gene expression in epidermal keratinocytes ［J］.J Dermatol Sci，2012，67(2):140-146.

［10］Ben-Bassat H，Klein BY.Inhibitors of tyrosine kinases in the treatment of psoriasis［J］.Curr Pharm Des，2000，6(9):933-942.

［11］Overbeck TR，Griesinger F.Two cases of psoriasis responding to erlotinib:time to revisiting inhibition of epidermal growth factor receptor in psoriasis therapy?［J］.Dermatology，2012，225(2):179-182.

Effect of Chinese gentian on the proliferation of,apoptosis and phosphorylation of epidermal growth factor receptor in HaCaT cells

Lou Yinfei，Ma Lili，Zheng Mingjing，Zhou Hui，Fang Yimiao.Department of Dermatology，First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310058，China

Ma Lili，Email:ma_lili@hotmail.com

Objective To evaluate the effect of Chinese gentian extracts on the proliferation of，apoptosis and phosphorylation of epidermal growth factor receptor(EGFR)in HaCaT cells induced by epidermal growth factor(EGF).Methods Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to evaluate the proliferation of HaCaT cells pretreated with EGF of 20 μg/L for 24 hours followed by 24 hours of treatment with various concentrations of Chinese gentian extracts.Flow cytometry was carried out to detect apoptosis in HaCaT cells pretreated with EGF of 20 μg/L for 24 hours followed by 4 hours of treatment with different concentrations of Chinese gentian extracts.Western blot was conducted to measure the level of phosphorylated EGFR in HaCaT cells treated with different concentrations of Chinese gentian extracts for 24 hours followed by treatment with EGF of 20 μg/L for 10 minutes.Results Chinese gentian extracts inhibited the proliferation(r=-0.991，P＜ 0.01)，but promoted the apoptosis(r=0.996，P＜ 0.05)of HaCaT cells induced by EGF in a dose-dependent manner.At the same time，the extracts suppressed the phosphorylation of EGFR in HaCaT cells induced by EGF，and the suppressing effect increased with the rise in the concentration of the extracts.Conclusions Chinese gentian may inhibit the proliferation，but promote the apoptosis of keratinocytes by decreasing EGFR phosphorylation and blocking relevant intracellular signaling pathways.

Gentian；Keratinocytes；Cell proliferation；Apoptosis；Receptor，epidermal growth factor

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.018

浙江省自然科學基金(Y2091225)

310058杭州,浙江中醫藥大學附屬第一醫院皮膚科

馬麗俐,Email:ma_lili@hotmail.com

2013-10-30)

(本文編輯:尚淑賢)