UPLC-MS/MS法測定奶粉中煙酸的含量

文∕郝 剛 俞蘊莉 顧炳仁

（1江蘇省蘇州市食品藥品檢驗所；2江蘇省蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院）

煙酸（Nicotinic Acid），又名尼克酸、維生素B3（或維生素PP），是人體必需的13 種維生素之一，具有促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝和擴張血管等功能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。目前，市售的眾多品牌奶粉中均將煙酸作為重要的營養(yǎng)成分進(jìn)行添加。本試驗基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)，采用多反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM），建立了快速測定奶粉中煙酸含量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Waters公司；電噴霧離子源（ESI+）；Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Waters）；Thermo低溫離心機；KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器；MILLIPORE純水儀；強陽離子交換（SCX）固相萃取柱（北京明尼克分析儀器設(shè)備中心）。

1.2 樣品與試劑

煙酸對照品（批號201102，含量99.9%），購于中國食品藥品檢定研究院；乙酸銨，購于Sigmaaldrich公司；甲醇，色譜純，購于Merk公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉等均為分析純，購于國藥試劑有限公司。試驗用水為超純水。試驗所用樣品均為市售奶粉。

1.3 UPLC 色譜條件

色譜柱：BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相：A（含20 mmol/L乙酸銨的水溶液）∶B（甲醇）=20∶80（v/v）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣盤溫度：4 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；毛細(xì)管電壓4.0 kV；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣體流量：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；碰撞氣體為氬氣，碰撞能18 eV；多反應(yīng)檢測模式（MRM）下，測定煙酸的檢測離子對分別為：m/z 124→106和m/z 124→80。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取煙酸對照品約10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，作為煙酸對照品儲備液（10 μg/mL），4 ℃避光保存。臨用前用甲醇稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.6 樣品前處理

稱取1 g奶粉置于燒杯中，加入適量的45～50 ℃的溫水將其溶解，冷卻至室溫后，加水補足100 mL，充分溶解、混勻后，取10 mL樣品溶液于50 mL聚丙烯離心管中；加入10 mol/L的氫氧化鈉0.1 mL、5 g氯化鈉和40 mL水，渦旋振蕩3 min，8 000 r/m離心5 min。取上清液10 mL置于另一個50 mL聚丙烯離心管中，加入0.2 mol/L的鹽酸40 mL，渦旋振蕩3 min，8 000 r/m離心5 min，取上清液10 mL上樣至SCX小柱中。然后依次用3 mL水，1 mL 0.2 mol/L的鹽酸和3 mL甲醇淋洗，用4 mL氨水-甲醇（體積比1∶3）洗脫，洗脫液經(jīng)氮氣吹干后用流動相定容至10 mL，0.22 μm濾膜過濾，取1 μL濾液進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

將煙酸對照品儲備液用甲醇稀釋成200 ng/mL的對照溶液，選用ESI+離子化模式，通過直接進(jìn)樣法進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。首先，采用一級質(zhì)譜掃描方式得到煙酸準(zhǔn)分子離子峰m/z：124[M+H]+，結(jié)果如圖1－（A）所示。在確定準(zhǔn)分子離子的基礎(chǔ)上，進(jìn)行錐孔電壓優(yōu)化，得到最佳錐孔電壓為30 V，錐孔氣流量為150 L/h。再通過Daughter Scan掃描模式，對煙酸的分子離子進(jìn)行二級碎片離子掃描，結(jié)果如圖1－（B）所示。煙酸二級掃描的特征離子對為：m/z 124→106和m/z 124→80，這2 個特征離子對作為煙酸定性判斷的依據(jù)。最后，基于煙酸的2 個特征離子對建立MRM方法，煙酸的MRM離子流色譜圖如1－（C）所示，并選擇其中響應(yīng)較強的離子對（m/z 124→80）作為定量離子對。

圖1 質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

2.2 專屬性

分別取空白奶粉（經(jīng)測定不含煙酸的奶粉樣品），空白奶粉添加至200 ng/mL水平的煙酸對照品，按“1.6 樣品前處理”方法經(jīng)提取、固相萃取后進(jìn)樣分析。同時用甲醇配制200 ng/mL的煙酸對照品溶液進(jìn)樣分析，考察所建立方法的專屬性，結(jié)果如圖2所示。煙酸對照品溶液的MRM離子流色譜圖保留時間為0.45 min，空白樣本在該保留時間處無干擾，空白樣品添加煙酸對照品溶液后，MRM離子流色譜圖保留時間不變，且峰形良好，所建液相及質(zhì)譜方法適合奶粉中煙酸的定性、定量檢測。

圖2 專屬性試驗結(jié)果

2.3 線性范圍

取煙酸對照品儲備液，分別配制成終濃度為1，2，5，20，50，100，200，500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述液相及質(zhì)譜方法，各取1 μL進(jìn)樣分析，采集MRM離子流色譜圖，以m/z 124→80為定量離子對，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，煙酸在1～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，線性方程為Y=9855X+93501，相關(guān)系數(shù)：R=0.9995。

圖3 煙酸線性范圍考察結(jié)果

2.4 檢出限與定量限

2.4.1 儀器檢出限與定量限

空白奶粉溶液中分別添加至0.1 ng/mL和0.3 ng/mL濃度水平的煙酸對照品，經(jīng)提取、固相萃取后，進(jìn)樣分析，結(jié)果如圖4－（A）所示，0.1 ng/mL濃度的煙酸信噪比（S/N）為6.8，該濃度作為煙酸的儀器檢出限（S/N>3）；0.3 ng/mL濃度的煙酸信噪比（S/N）為13.97（如圖4－（B）所示），該濃度作為煙酸的儀器定量限（S/N>10）。

圖4 煙酸檢出限（A）、定量限（B）試驗結(jié)果

2.4.2 方法檢出限與定量限

根據(jù)“1.6 樣品前處理”的方法，樣品實際稀釋倍數(shù)為2 500 倍，計算該方法下的方法檢出限為0.25 μg/g，方法定量限為0.75 μg/g。

2.5 回收率和精密度

取空白奶粉溶液，分別添加2 ng/mL，20 ng/mL，200 ng/mL共3 個濃度水平的煙酸對照品溶液，按本試驗方法進(jìn)行處理，每份樣品重復(fù)測定6 次，試驗結(jié)果如表1所示。考察煙酸低、中、高3 個濃度下的方法回收率，在78.2%～90.4%范圍內(nèi)，方法精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示）小于7%。

表1 空白樣品中煙酸的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

2.6 實際樣品測定

選取市售6 種不同批次標(biāo)示含有煙酸成分的奶粉，按所建方法進(jìn)行樣品處理并檢測煙酸含量，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，6 種批次奶粉中煙酸含量的實測值均在“80%標(biāo)示值～120%標(biāo)示值”范圍內(nèi)，符合我國《食品營養(yǎng)成分標(biāo)示準(zhǔn)則》的相關(guān)規(guī)定。

表2 奶粉樣品分析結(jié)果

3 討論

目前，國內(nèi)外檢測煙酸含量的方法主要包括滴定法、微生物法、高效液相色譜法、電化學(xué)法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法等。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中煙酸的測定方法為高效液相色譜法和微生物法（GB 5413.15－2010）。本試驗基于超高效液相色譜的快速分離能力及三重四級桿質(zhì)譜的定性、定量優(yōu)勢，開發(fā)快速測定奶粉中煙酸含量的檢測方法。試驗結(jié)果表明，不含煙酸的空白奶粉樣品經(jīng)提取、固相萃取后，在MRM監(jiān)測模式下對煙酸的基線分離無影響，方法專屬性強，且煙酸保留時間僅為0.45 min，大大縮短了分析時間。進(jìn)一步分析目前市售各種品牌的奶粉營養(yǎng)成分表發(fā)現(xiàn)，多數(shù)品牌奶粉中煙酸的含量在1～10 mg/100 g范圍內(nèi)，本試驗中所建立的煙酸對照品溶液的線性范圍為1～500 ng/mL。結(jié)合所建方法的提取、固相萃取過程，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)和回收率的計算結(jié)果，該方法運用在實際樣品的檢測中，線性范圍可達(dá)0.25～125 mg/100 g，基本滿足目前市售的不同品牌奶粉中煙酸的測定要求，且方法回收率在78.2%～90.4%范圍內(nèi)，精密度小于7%。進(jìn)一步運用所建方法對市售6 批奶粉中的煙酸含量進(jìn)行檢測，結(jié)果均符合規(guī)定。綜上所述，本試驗所建立的奶粉中煙酸含量檢測方法具有專屬性強、靈敏度高、線性范圍廣、分析時間短等優(yōu)點，為奶粉中煙酸的檢測提供了新的選擇。

[1]Batra V，Kislay B.Mitigation of gamma-radiation induced abasic sites in genomic DNA by dietary nicotinamide supplementation:metabolic up-regulation of NAD（+）biosynthesis.Mutat Res，2013（9）：28-38.

[2]Lojolter M，Meyer U，Rauls C，et al.Effects of niacin supplementation and dietary concentrate proportion on body temperature,ruminal pH and milk performance of primiparous dairy cows.Arch Anim Nutr，2013，67（3）：202-218.

[3]Kirkland J B.Niacin requirements for genomic stability.Mutat Res，2012（5）：14-20.

[4]關(guān)靜，霍艷艷，董春嬌.煙酸類藥物的研究進(jìn)展.沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，13（2）：110-112.

[5]薄海波，龐國芳，雒麗麗，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶和奶粉中殘留的左旋咪唑].色譜，2009（27）：149-152.

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品營養(yǎng)標(biāo)簽管理規(guī)范.2007.

[7]Semi E，Audino V，Delcarlo S，et al.Determination of watersoluble vitamins in multivitamin dietary supplements and in artichokes by micellar electrokinetic chromatography.Nat Prod Res，2013，27（23）：2212-2215.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：771.

[9]白鴻.保健食品功效成分檢測方法.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2011：66.

[10]袁碩.高效液相色譜法測定食品中煙酸的比較.生物技術(shù)，1999，9（2）：39-41.

[11]程發(fā)量，莫金垣，戴曉云.煙酸的電化學(xué)行為與測定.分析測試學(xué)報，1999，18（1）：21-23.

[12]郗英欣，郎惠云，謝志海，等.原子吸收光譜法測定煙酸含量的研究.西安交通大學(xué)學(xué)報，1997，31（4）：87-92.

[13]呂元琦，鄔春華，袁倬斌.毛細(xì)管電泳法測定藥片中煙酸.理化檢驗-化學(xué)分冊，2006，4（42）：299-303.

[14]莊付磊，崔慶新，柳仁民.硅烷化衍生-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定煙酸.理化檢驗-化學(xué)分冊，2010，46（5）：506-508.

[15]王丹彧，王萌萌，馬迪，等.HPLC法測定煙酸片中煙酸的含量.中國藥房，2013，5（16）：1515-1516.

[16]汪秀月.HPLC法測定煙酸片的含量.海峽藥學(xué)，2010，22（5）：69-71.

[17]張立升，呂文軍.紫外分光光度法測定煙酸片含量.哈爾濱醫(yī)藥，2012，32（1）：14.

[18]GB 5413.15－2010 嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定.