液相色譜-串聯質譜法檢測牛奶中β-內酰胺類藥物殘留的研究

文∕賈 濤

（北京市飼料監察所）

1 方法原理

牛奶中β-內酰胺類藥物經乙腈提取，正己烷脫脂后，經C18凈化小柱凈化，取適量上清液過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

2 試劑和材料

以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規定的二級水。

青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮對照品（純度均大于95.0%）；乙腈（色譜純）；正己烷；甲酸（色譜純）。

標準儲備液（1 mg/mL）：準確稱取適量的青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮，用50%乙腈水溶液溶解稀釋，分別配制成1 mg/mL的標準儲備液。4 ℃下保存，有效期為1 周。

混合標準工作液（10 μg/mL）：分別準確吸取0.1 mL的青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮標準儲備液至10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻即得。4 ℃下保存，有效期為1 周。

3 儀器和設備

超高效液相色譜-串聯質譜儀（配電噴霧離子源，美國Waters公司，Waters Quattro Premier XE）；分析天平（感量0.00001 g）；天平（感量0.01 g）；高速離心機；渦旋混合器；水平振蕩器；固相萃取裝置；BakerBond C18固相萃取柱（500 mg/6 mL，或相當者）；氮吹儀；濾膜（0.22 μm）。

4 試驗方法

4.1 試驗儀器條件

4.1.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫：0～1 min，維持5%A；1～2.5 min，5%A線性變化至50%；2.5～4 min，維持50%A；4～5 min，維持5%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

4.1.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測；電離電壓：3.2 kV；源溫：110 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：50 L/h；霧化氣流速：650 L/h；測試藥物定性、定量離子對及對應的錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 13 種β-內酰胺類藥物定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量

4.2 樣品前處理

4.2.1 提取

稱取（2±0.02）g牛奶樣品，置于50 mL離心管內，加乙腈8 mL，渦旋混合后，中速振蕩5 min，10 000 r/min離心10 min。取上清液于另一個50 mL離心管內，加正己烷5 mL，渦旋混合后中速振蕩5 min，5 000 r/min離心5 min，棄上層有機相，下層溶液作為備用液。

4.2.2 凈化

C18小柱依次用乙腈5 mL、水10 mL活化，取全部備用液過柱同時收集于15 mL玻璃試管內，擠干，于40 ℃下氮氣吹至體積小于1 mL。加水定容至1 mL，充分渦旋混勻，轉移至1.5 mL塑料離心管內，15 000 r/min離心10 min，取適量上清液過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

4.2.3 測定法

取試料溶液和基質匹配標準溶液，作單點或多點校準，外標法計算。試料溶液和基質匹配標準溶液中青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮的特征離子質量色譜峰面積均應在儀器檢測的線性范圍之內。試料溶液中的離子相對豐度與基質匹配標準溶液中的離子相對豐度相比，符合表2的要求。

表2 試料溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍

4.2.4 結果計算和表述

或基質匹配標準曲線校準：由As＝aCs＋b，

式中：

X——供試試料中β-內酰胺類藥物殘留量（μg/kg）；

Cs——基質匹配溶液中相應β-內酰胺類藥物濃度（ng/mL）；

C——供試試料溶液中相應β-內酰胺類藥物濃度（ng/mL）；

As——基質匹配溶液中相應β-內酰胺類藥物峰面積；

A——供試試料溶液中相應β-內酰胺類藥物峰面積；

V——濃縮后定容體積（mL）；

m——供試試料質量（g）。

注：計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數字。

4.3 線性范圍

分別準確量取13 種β-內酰胺類藥物系列混合標準溶液0.1 mL，依次加入空白組織經提取、凈化及濃縮后的溶液中，加水定容至1 mL，充分混勻，制得濃度為5、10、50、100、200和500 ng/mL的基質匹配系列混合標準溶液，離心過濾后上機測定。以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。空白牛奶基質匹配得到的回歸方程及相關系數（R2）見表3。從中可以看出：13 種β-內酰胺類藥物在5～500 ng/mL的濃度范圍內呈現良好的線性關系，R2均大于0.990。

表3 13 種β-內酰胺類藥物回歸方程及相關系數（R2）

4.4 方法的靈敏度

空白試樣按相同的步驟處理后進行測定，測定結果表明：在相應的保留時間，空白試樣對所測分析物無干擾。檢測限（LOD）與定量限（LOQ）：添加適量混合標準溶液于2 g空白樣品，經提取凈化后測定，根據所測藥物的S/N＞3（按PtP算）為方法檢測限，S/N＞10（按PtP算）為方法定量限的原則，測得青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮13 種藥物在牛奶中的檢測限為1 μg/kg，定量限為2 μg/kg。

4.6 檢測方法的準確度和精密度考察

采用標準添加法，在空白牛奶中添加低、中、高3個不同濃度的13 種β-內酰胺類藥物進行回收率試驗，各濃度進行5 個樣品平行試驗，重復3次，求批內、批間相對標準偏差，匯總結果見表4。從表中試驗結果可以看出，本方法在空白牛奶中進行2～300 ng/g添加濃度檢測，方法的回收率為70%～120%，批內、批間相對標準偏差均小于20%。

表4 空白牛奶中13 種β-內酰胺類藥物添加回收率試驗（n=5）

5 結果與討論

5.1 線性范圍

空白基質中13 種β-內酰胺類藥物在5～500 ng/mL濃度范圍內線性相關，相關系數均大于0.990。

5.2 靈敏度

青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、頭孢喹肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉和頭孢哌酮在牛奶中的檢測限為1 μg/kg，定量限為2 μg/kg。

5.3 精確度

在牛奶添加濃度為2～50 μg/kg范圍內，本方法的回收率為70%～120%；批內、批間RSD均小于20%。

5.4 β-內酰胺類藥物的殘留情況與研究檢測方法的意義

β-內酰胺類藥物（β-lactams）具有自然界中鮮見的β-內酰胺基母核，其中發展迅速、品種較多的兩類是青霉素類（penicillins，PENs）和頭孢菌素類（cephalosporins，又稱先鋒霉素）。常見的青霉素類藥物包括天然的青霉素G（又稱芐青霉素）等以及半合成的阿莫西林、氨芐西林和苯唑西林等；頭孢菌素類藥物較青霉素類穩定，具有過敏反應低，殺菌力強等優勢，該類藥物品種繁較多，不斷更新，典型的有頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢唑啉等。

β-內酰胺類藥物在醫學和獸醫上都是重要的一類抗菌藥物，應用十分廣泛。由于過敏反應及細菌產生耐藥性等原因，許多國家都對動物使用該類藥物以及在動物源食品中的殘留情況進行了嚴格監控。歐盟、美國和我國等多個國家都制定了牛奶等食品中的最高殘留限量。β-內酰胺類藥物殘留分析方法已有大量報道，主要有液相色譜法（HPLC）法、免疫分析法和微生物測定法等，本方法采用快速簡便、專屬性強、靈敏度高的液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）法作為該類藥物的確證方法，以保障對該類獸藥的殘留監控。

5.5 前處理條件的確定

對于β-內酰胺類藥物的提取大多使用水和有機溶劑進行提取，有時還要加入鎢酸鈉、硫酸等無機酸來沉淀蛋白質，但是一些天然的藥物，如青霉素G等不耐酸，在酸性條件下又易分解，因此最終試驗中采用了1∶4的水和乙腈進行提取的方法。為降低背景雜質對分析物的干擾，常需做進一步的凈化，常用的固相萃取柱為C18柱和HLB柱，本試驗比較了Sep-pak、Supelco、Varian、BakerBond C18小柱和HLB小柱，結果發現使用填料致密的BakerBond C18小柱去除雜質、凈化樣品的效果最好。

5.6 離子對的確定

根據歐盟2002/657/EC要求，要確證β-內酰胺類藥物至少需要3 個識別點（IP），試驗中分別選擇了母離子以及對應的2 個響應較強的子離子作為定性依據，這樣，1 個母離子有1個IP點，對應的2 個子離子分別有1.5 個IP點，達到了4 個IP點，很好地滿足了歐盟有關法規的要求。

6 結論

通過線性范圍試驗、回收率試驗等認為，液相色譜-串聯質譜法檢測速度較快、定性定量準確、回收率較高，完全能滿足13 種β-內酰胺類藥物在牛奶中殘留檢測方法的要求。