植物促生菌劑對甘草生長影響的研究

馬文彬，王占軍，姚 拓，張玉霞，王國基

（1.甘肅農業大學 草業學院／草業生態系統教育部重點實驗室／甘肅省草業工程實驗室／中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏農林科學院荒漠化治理研究所，寧夏 銀川750002）

近10年，人類對農產品的需求不斷增加，為提高產量致使農業生產中大量施用化肥，中藥材栽培中化肥施用量也居高不下。研究證實，各種形態的氮肥施入土壤后，都會形成硝態氮，導致土壤酸化及土壤理化性質惡化，促使土壤中一些有毒有害污染物釋放和增加［1，2］。磷肥由于其特殊的加工工藝及原料中含有多種重金屬、有害雜質及放射性物質［3，4］，使土壤及作物受污染。2002年6月1日《中藥材生產質量管理規范（試行）》（GAP）允許限度使用化學肥料，限量使用高效、低毒、低殘留農藥。但由于人工栽培的中藥材多為多年生藥用植物，使用化學肥料勢必造成有害成分和重金屬在中藥材中的蓄積，影響藥材品質和下茬作物的種植［5］。有學者研究發現在植物根際存在能夠固定空氣中的氮氣，分解土壤磷素，分泌植物生長激素及防治植物病害等有益微生物菌群，被稱為植物根際促生菌［5］（PGPR）。利用PGPR制備的微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制農作物對硝態氮、重金屬、農藥的吸收，凈化和修復土壤，降低農作物病害發生，促進農作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用，保護環境以及提高農作物產品品質和食品安全等方面已表現出不可替代的作用［7］。為維持自然界的生態平衡及農業的可持續發展，應用微生物肥料對于中藥材GAP種植具有重要意義。

甘草（Glycyrrhizauralensis）為豆科多年生草本植物，地上部分粗蛋白、粗脂肪含量高，粗纖維含量低，因根和莖均能入藥［9］，是中醫最常用的藥物之一，有“十方九草”之稱。此外還在食品和輕工業等方面廣為應用［10］，同時對干旱地區的防風固沙、綠化荒漠、維護生態平衡等有著重要作用［11］。由于甘草應用廣泛，需求量連年上升，加之野生甘草資源的破壞，栽培甘草成為甘草藥材的主要來源。

目前，國內外對甘草的研究多集中在化學成分的提取、分離和有效成分的開發及甘草的分類鑒定等方面［12］。此次研究以甘草為研究對象，利用前期從甘草及其他植物根際分離篩選的5株優良促生菌株進行甘草促生試驗，測定其對甘草生長的影響，篩選出最優菌株，為甘草GAP栽培及研制甘草根際專用生物肥提供理論和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 供試植物

供試甘草品種為烏拉爾甘草。種子由寧夏農林科學院荒漠化治理研究所提供。

1.2 菌株來源及特征

供試菌株為甘肅農業大學草業學院草地生物多樣性實驗室提供的5株優良促生菌，其特征見表1。

1.3 培養基及營養液

LB培養基［13］：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL，pH 7.0。

霍 格 蘭 營 養 液［14］：1mol／L MgSO4·7H2O 4mL，1mol／L Ca3（PO4）22mL，1mol／L CaCl2·2H2O 10mL，1mol／L KCl 10mL，Fe·EDTA 2mL，微量元素營養液2mL，Agar 2g。

微量元素營養液配方（500mL）：HBO30.310g，MnSO41.115g，ZnSO4·7H2O 0.430g，NaMoO4·2H2O 0.012 5g，CuSO4·5H2O 0.001 25g，CoCl20.001 25g，KI 0.037 5g。

表1 供試菌株Table1 Strains for test

1.4 研究方法

1.4.1 菌懸液制備 將LB斜面培養基上生長72h的5種菌分別接種于100mL LB液體培養基中，置于28℃，125r／min的搖床培養3～5d，測定D660nm值，使D660nm值均＞0.5，無菌水調節D660nm值一致（使菌數量處于同一水平），制成單一菌懸液。

1.4.2 種植 選取籽粒飽滿、大小均一的甘草種子，將種子先用75%的酒精滅菌處理15s，然后，用無菌水沖洗4～5次，再經過0.1%HgCl2滅菌處理10min后，用無菌水沖洗干凈，將種子置于滅菌后的水瓊脂培養基平板中，置于25℃培養箱（28℃，16h光照，20 000lx，8h黑暗）中培養，待種子芽長1～2cm，將甘草幼苗移至裝有40mL無菌Hoagland水瓊脂半固體培養基的長玻璃試管（4cm×45cm）中，每個試管1株幼苗，置于培養箱中培養，2d后觀察，去除移栽后死亡的幼苗。

1.4.3 接種 將1.4.1中各單一菌懸液1mL在無菌條件下接入1.4.2所培養的幼苗根際，接種后將試管繼續置于培養箱中培養。設1組為對照，每個處理5次重復。

1.4.4 測定項目與方法 經過處理的幼苗培養40d后收獲，用無菌水洗凈根表培養基，測量株高及根長；剪去地上部分，利用根系掃描儀（LA2400Scanner，Epson Expression 1000XL）測定根表面積、根體積及根平均直徑；經105℃殺青15min后在70℃下烘干至恒重，分別稱量地上和地下部分干重。

1.5 數據處理

利用Excel 2007整理數據，SPSS17.0進行方差分析和主成分分析，采用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 促生菌劑對甘草生長的影響

2.1.1 對株高的影響 通過測定不同促生菌劑對甘草株高的影響表明（表2），接種不同促生菌劑后，甘草株高與對照有顯著差異，增幅為17.5%～32.8%，其中Jm92最好，Jm170次之，RP1最差。方差分析表明：Jm170和Jm92與對照相比差異顯著（P＜0.05），其他處理之間差異不顯著，Jm92對甘草株高的促進作用達到了極顯著水平（P＜0.01），較對照增加32.8%；其次為Jm170，較對照增加27.1%；RP1株高小于對照。

2.1.2 對植株生物量的影響 對甘草地上、地下生物量測定表明（表2），促生菌劑對其有明顯促進作用，其中地上部分與對照相比增加5.8%～51.5%。Jm92最為顯著，RP1促生效果最差，但較對照相比也增加了5.8%。其中Jm92，Jm170和RS5與對照相比差異顯著（P＜0.05），而且Jm 92對地上生物量的增加達極顯著水平（P＜0.01）。Jm92對地下生物量的促生效果最好，較對照增加202.3%，RS5次之，達到175.6%。Jm92、Jm170和RS5較對照差異達極顯著水平（P＜0.01），說明施用促生菌劑可增加甘草的生物量。

2.2 促生菌劑對甘草根系性狀的影響

對根表面積、根體積、根平均直徑和根長等根系指標測定表明（表3），與對照相比，5個處理分別使甘草根表面 積 增 加 186.2%，117.4%，37.9%，176.8%，168.1%，其中，RS1的處理效果與對照相比差異極顯著（P＜0.01），除RP1外，其他處理與對照相比差異顯著（P＜0.05）。由此可見，各菌劑處理對甘草根表面積具有顯著的增加作用；各處理對根體積的促生效果明顯，較對照增加148.5%、130.3%、7.58%、121.2%和180.3%，除RP1以外其余處理較對照差異極顯著（P＜0.01）；各處理對根平均直徑影響不同，RP1，RS5和Jm92對其直徑增加明顯，較CK分別增加了36.4%，17.8%和14.7%，RS1和Jm170對直徑影響則不及對照，僅RP1與CK差異顯著（P＜0.05）。各處理對根長影響不及其他指標顯著，但除RP1外均有增加，僅Jm170與對照差異極顯著（P＜0.01），達92.4%，其余處理較對照無顯著促進作用。

表2 不同促生菌劑下甘草的生長Table2 Effect of PGPR inoculum on growth of Radix glycyrrhizae

表3 不同促生菌劑下甘草的根系性狀Table3 Effect of PGPR inoculum on root triaits of Radix glycyrrhizae

2.3 不同促生菌劑對甘草生長的重要性

將供試菌株的根表面積、根體積、根平均直徑、根長、株高、地上生物量和地下生物量7個性狀作為自變量，進行主成分分析。在7個因子中，前2個因子的累積貢獻率已經達到88.075%，因此，在主成分分析中只需取前2個主成分。從綜合得分及排名來分析（表4），Jm92最高，促生效果最好；RP1得分最低。

3 討論

PGPR菌既可幫助植物從環境中攝入養分（如聯合固氮），直接促進植物生長，也可通過減輕或預防不良環境因素（如病原菌、重金屬等）給植物造成的傷害，從而間接促生［15］，同時可溶解土壤中某些難溶性物質（如溶磷菌），以達到促進植物生長、增加作物產量，并且提高作物品質的效果。近年來，國內外學者就各種接種劑對植物的促生作用進行了大量研究，如榮良燕等［16］研究指出，復合菌肥替代20%化肥用量可使成熟期玉米地上生物量鮮重提高10%，替代20%～30%的化肥可提高4%～8%的籽實產量。胡江春等［17］研究表明，海洋放線菌MB－97對克服重茬大豆連作障礙具有顯著作用，對大豆有生長刺激作用，大豆田間試驗平均增產15.2%?？蒂O軍等［18］接種PGPR對豇豆幼苗的促生作用認為，浸種處理幼苗的株高及莖葉干物重均有增加。韓文星等［18］在燕麥上接種PGPR菌肥研究發現，PGPR菌肥與半量化肥配施后，燕麥主根長、根體積和根系干重均有明顯增加。目前，PGPR的作用機制尚不完全清楚，但有研究認為，PGPR可誘導植物分泌生長素、溶磷菌將土壤中難溶性磷轉化為植物可吸收利用的磷、增強植物對病原菌和環境脅迫的抗性和耐受力等［20］。本研究利用前期篩選的優良促生菌株對甘草的促生試驗表明，不同接種劑均可增加甘草株高及生物量，這與席琳喬等［20］在燕麥上接種聯合固氮菌株后大多數菌株明顯促進燕麥生長（株高、根長、根表面積和生物量）的研究結果基本一致。從國內外學者的研究可看出，促生菌肥在田間的應用效果存在著很大差異。有報道接種外源PGPR后，其存活、競爭及促生作用受接種濃度、接種技術和土壤環境等諸多因素的影響，由此也會影響促生效果。本研究在培養基條件下初步篩選甘草根際促生菌，對于如何優化各種因子，以達最佳田間接種效果還需要進一步的深入研究。

表4 甘草主成分得分及綜合得分Table4 Principal score and general score

根系是作物吸收水分和養分的重要器官，是最先感受到養分脅迫和逆境脅迫的器官［21］，而根系表面積是根系與土壤之間進行營養交換的界面，根系體積是根與土壤的接觸面積，直徑增粗可降低由供氮不足引起的細根衰老和死亡的機率［22－23］，因此，根系形態特征與植物利用土壤養分的效率密切相關，且根系表面積大，根體積大是磷高效利用的主要特征［24］。甘草廣泛分布于西北具鹽漬化土壤、光照強、溫差大和多風沙的干旱環境中，藥用部分為干燥根及根莖，其地下根莖所占比重大于主根，且主要依靠橫走根莖上的休眠芽進行無性繁殖，因此，根系的生長發育對甘草尤為重要。試驗研究在甘草幼苗上接種不同促生菌劑后甘草根系表面積、體積及直徑增加明顯，由此可見，促生菌劑對根系性狀的影響充分說明PGPR可增強根系吸收水分、養分的能力，這對于生長在干旱條件下的甘草極為有利。

譚周進等［25］證實磷是植物體內能量傳遞和轉化的重要元素，直接或間接地影響生物固氮和固氮酶活性。研究中選用的菌株Jm92和Jm170有較高的固氮酶活性，能夠固定空氣中的氮為植物提供氮素，并且具有溶磷作用，因此，較對照菌株生長良好，尤其是這兩種菌對于甘草根的影響極為顯著，且Jm92優于Jm170，這與菌株的固氮效應有密不可分的關系。而Sigleton等［26］的研究認為，一旦土壤中土著根瘤菌的數量達到一定閾值時，接種根瘤菌并不能產生較大的作用。因此，在土壤環境中或者甘草根瘤存在等有氮條件下，促生菌株的促生效應是下一步研究的重點。

4 結論

供試菌株中Jm92，Jm170和RS1對甘草生長均表現出不同程度的促進作用，在研制甘草根際專用肥中具有較大潛力，但田間的應用效果還需進一步研究。由于PGPR是從植物根際篩選出來，再次回歸到植物根際，不僅可減少化肥對土壤的污染及對微生物區系的破壞，還可增加藥材產量，避免化肥使用過多而導致的藥材安全問題。因此，微生物接種劑的使用具有社會和生態雙重意義，為GAP種植開辟新路徑。

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