色素細胞譜系及其發育調控研究進展

文 勝，劉錦輝，張永勤，肖亞梅

(湖南師范大學生命科學學院，教育部蛋白質化學和魚類發育生物學重點實驗室，中國長沙 410081)

色素細胞是動物體內含有生物色素的一類特化細胞，通過其色素系統選擇性地吸收特定波長的光而產生顏色，從而形成動物體的體色.體色在保護個體免受天敵或紫外線傷害、信息交流和生理調節等方面有著重要生物學作用.本文概述了動物色素細胞譜系來源和組成，色素干細胞分化發育的分子調控相關研究進展.

1 色素細胞及色素細胞譜系

根據所含色素的不同，動物色素細胞主要有黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、虹彩細胞等4 種基本類型(圖1，彩圖見封三).黑色素細胞(melanophore)內含大量由酪氨酸、多巴胺等氧化聚合在體內合成的黑色素，能夠吸收特定波長的入射光而使身體呈現黑色.紅色素細胞(erythrophore)和黃色素細胞(xanthophore)形態非常相似，都含有胡蘿卜素與蝶啶的色素體.黃色素細胞和紅色素細胞與動物的黃、橙、紅體色有關，一般認為黃色素細胞擁有大量帶黃色的蝶酸色素，而紅色素細胞則含有較多呈紅色和橙色的類胡蘿卜素.虹彩細胞(iridophore)也稱為鳥糞素細胞(guanophore)或白色素細胞(leucophore)，其呈色物質主要是與水結合成晶體形式的鳥嘌呤，通過反射特定波長的光表現為白色、藍色和紫紅3 種色彩結晶體.上述幾種色素細胞類型的數量和分布、反光結晶體的能力強弱等，決定了動物體的顏色和斑紋［1－4］.黑色素細胞是動物體內存在最廣泛且研究得最多的色素細胞類型，而其他幾種非黑色素細胞則主要在體色鮮艷的低等脊椎動物，如魚類、兩棲類中較為常見.也正是由于與高等羊膜動物在色素細胞類型方面的差異，色彩斑斕的魚類已成為色素細胞譜系研究的重要材料.

圖1 魚類4 種色素細胞的顯微觀察(A:紅色素細胞(E)和虹彩細胞(I);B:黑色素細胞(M)和黃色素細胞(X))Fig.1 Four types of pigment cells in fish(A:Erythrocyte(E)and Iridocyte(I);B:Melanocyte(M)and Xanthophore(X))

對于色素細胞譜系的研究，主要集中于探究色素細胞是怎樣起源、遷移和分化，最后形成一定形狀的體紋.人們想知道色素細胞是怎樣按照特定的時序到達特定的部位形成特定的器官，這涉及到發育生物學的根本問題.神經嵴則是胚胎發育中短暫出現的過渡性結構，是由背部外胚層分化的位于神經管和表皮之間的細胞帶.色素細胞的前體細胞稱為色素胚或色素母細胞(chromatoblast)，是在胚胎發生時期，由神經嵴細胞發展而來的.色素母細胞具有分化為成黑色素細胞(melanoblast)、成黃色素細胞(xanthoblast)和成虹彩細胞(iridoblast)等色素干細胞的發育潛能.在斑馬魚中，黑色素細胞譜系的特化約在受精后24 h 就開始發生;孵化出膜后第3 天的斑馬魚胚胎中，就已經觀察到黑色素細胞、黃色素細胞與虹彩細胞;出膜2～4 周后，幼體黑色素細胞由成體黑色素細胞取代［5］.斑馬魚胚胎發育期出現的黑色素細胞一般認為都是由神經嵴細胞直接分化形成，出膜后的黑色素細胞則是由黑色素干細胞(melanocyte stem cell)發育而來［6］.

2 色素干細胞的發現及研究現狀

色素細胞的數目和組成直接由色素干細胞控制.色素干細胞的最早出現時間是從神經嵴發生色素細胞譜系的特化開始，隨后它們發生分化、增殖、遷移，最終定位于表皮基底膜之下或者毛發著生的毛囊龕中［6］.成體色素細胞的更新依賴于真皮干細胞.早在1954年，Goodrich 等就發現，在魚類黃色素細胞局部受損的區域，原本并不存在的黑色素細胞在此出現，這也就暗示了受損組織中有色素干細胞存在［7］.但由于缺乏對黑色素細胞的標記方法，未能區分是原本存在的黑色素細胞的遷移還是非色素化的前體細胞的分化導致新的黑色素細胞的產生.在斑馬魚中已經證實，大多數再生鰭條的黑色素細胞來源于非色素化的前體細胞［8］.人們從小鼠和人類均分離得到了皮膚干細胞，并在體外進行培養［9－10］.其中Li 等人獲得的人類真皮干細胞不僅能夠表達神經嵴的標簽基因NGFRp75 和nestin，而且還能表達在胚胎干細胞中高表達的OCT4;這些真皮干細胞雖然不表達黑色素細胞的標簽基因，但卻具有分化產生有功能的黑色素細胞的潛能，這與人類胚胎干細胞向黑色素干細胞的分化條件是相同的［10］.目前很多研究已經證實，在動物的真皮、毛囊中存在黑色素干細胞(melanocyte stem cell，MSC)［11－12］.Lin 等2013年首次在鳥類皮膚下方的圓筒形羽囊底部精確找到黑色素干細胞，并成功揭示出色素干細胞導致鳥類羽毛擁有獨特而又復雜的黑白圖案并隨著個體的生長保持動態平衡［13］.

人類膚色和發色主要是由兩種黑色素(黑色或褐色的真黑素Eumelanin 和紅色的棕黑素Pheomelanin)的含量不同所導致的.基于臨床研究的需要，目前對黑色素干細胞的研究較為深入，而有關黃色素干細胞等幾種非黑色素干細胞的研究資料則十分有限.研究顯示，斑馬魚胚胎成黑色素細胞與成虹彩細胞的標簽基因有顯著性的重疊，但是與成黃色素細胞的不同.該結果表明黑色素細胞與虹彩細胞可能來源于共同的前體細胞，而黃色素細胞則可能來自于不同的發育路徑［14］.同時Lister 等人也證實，在斑馬魚突變體中，成黑色素細胞能夠改變原來的細胞譜系命運轉變成為成虹彩細胞［15］.然而，利用譜系特異的轉座子對斑馬魚早期胚胎進行標記發現，來自于真皮干細胞的mFSCs(the same melanocyte－producing founding stem cells)具有分化為黑色素干細胞的發育潛能，同時成體黃色素細胞可能和黑色素細胞一樣來自于相同的前體干細胞mFSCs;而虹彩細胞則可能由另一種前體細胞iFSCs(iridophores arise from a distinct founding stem cell)產生(如圖2所示)［8］.目前對于色素干細胞的分化發育途徑還沒有一致性的結論.

圖2 成體色素細胞發育路徑Fig.2 Development of pigment cells in adult animal

3 色素細胞譜系發育的分子調控機制

神經嵴細胞分化產生色素細胞以及成體體色模式的發育和維持，涉及到非常嚴格而復雜的分子調控.在大規模ENU 誘導突變和篩選過程中，發現了大量的體色突變斑馬魚品系，這些突變體正在成為研究人類體色多樣性和體色失常的強有力工具.這些突變的基因，功能涉及黑色素細胞的早期決定(如sox10，mitf)、遷移(如kit)、黑色素的合成(如tyr，dct)等等［14，16－18］.

Mitf(microphthalmia transcription factor)基因是黑色素細胞譜系中已知最早的特異性的標簽基因［19－20］.在哺乳動物中MITF 至少有6 個異構體［21］，其中MitfA，MitfD，MitfH 是視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)發育必須的，而MitfM 只在黑色素細胞發育過程中起作用［22－23］.人類mitf 基因突變可以導致Waardenburg 綜合癥，引起皮膚黑色素細胞缺失和皮膚斑駁樣色素減退、聽覺神經性耳聾［24］.mitfa 和mitfb是魚類中分離到的mitf 基因的兩個亞型［15，25］.青鳉中也獲得了mitfa 和mitfb 的同源基因［26］.mitfa 基因對魚類體色的黑色素細胞發育起著重要調控作用，但不影響眼色素的發育;而mitfb 基因則只參與眼色素上皮細胞的發育［25－27］.

MITF 在生物體內能調控黑色素合成關鍵限制酶——酪氨酸酶基因(tyr)的表達，影響黑色素細胞的分化［28］.在mitfavc7/ BRAFV600E 斑馬魚的黑色素瘤模型中，通過溫敏控制MITF 表達水平，發現低劑量MITF能誘導黑色素瘤;若完全抑制MITF 表達，則導致黑色素瘤的消退［29］.MITF 通過影響tbx2、cdk2、p16 和p21等細胞周期調控基因，控制黑色素細胞的生長［22，30－31］.mitf 基因的表達受到CREB、SOX10 和PAX3 等信號通路的調控(圖3)，SOX10 通過結合到mitf 的調節序列中，激活mitf 的轉錄，是黑素瘤細胞維持正常發育和生存潛勢的主要調控基因［32］.研究表明，Ednrb 信號通路對神經嵴來源的黑色素前體細胞的增殖、存活以及黑色素細胞的分化是必須的，G 蛋白偶聯Ednrd 受體及其配體Et3 與胚胎色素細胞及幼體色素細胞向成體色素細胞的轉變有關［33－34］.

圖3 mitf 基因對黑色素細胞發育的調控機制Fig.3 The mechanism of mitf gene in the development of melanocyte

黃色素細胞譜系和虹彩細胞譜系的標簽基因已經成功獲得了鑒定.Odenthal 在斑馬魚中篩選了多個與黃色素細胞的形成和遷徙相關的基因［35］.除了較早所知的成黃色素細胞的標簽基因csf1(colony stimulating factor-1)［36］，人們又發現pax 家族中的pax7 在黃色素細胞譜系中特異性表達，認為pax3 與pax7 共同調控由神經嵴向黃色細胞的發育［37］.Lopes 報道了一個虹彩細胞缺失的斑馬魚突變體Shady(shd)，經鑒定，shd 的白細胞酪氨酸激酶Ltk(leukocyte tyrosine kinase)同源基因發生了突變［38］.ltk 基因在成黑色素細胞和成黃色素細胞中不表達，可以作為虹彩細胞的前體細胞的基因標簽.此外，foxd3 可能作為黑色素細胞譜系與虹彩細胞譜系之間的轉換開關，與mitf 基因共同參與了對黑色素細胞譜系和虹彩細胞譜系的分化發育調控［14］.

4 色素細胞譜系研究展望

目前，對色素細胞譜系，尤其是黑色素細胞譜系的定位、分化發育及其相關基因調控機制已經有了較深入的了解.魚類及其他含有多種色素細胞類型的低等脊椎動物的色素表型較羊膜動物復雜，涉及3 種或更多色素細胞的有序組合，紅/黃色素細胞譜系、虹彩細胞譜系的分化調控及其與黑色素細胞譜系的發育關聯尚待進一步研究.

Ohta 等利用Yamanaka 誘導體系的SOX2、OCT3/4、KLF4 和c－MYC，成功將人皮膚成纖維細胞誘導為iPS細胞.同時通過添加Wnt3a，SCF 和ET－3 對獲得的iPS 細胞進一步誘導分化后，檢測到TYR、TYRP1 等黑色素細胞標記分子的表達，并且觀察到培養細胞中黑色素體的存在，表明從iPS 細胞誘導產生了黑色素細胞［39］.通過體外培養iPS 細胞產生色素細胞這一體外誘導分化體系的建立，一方面為再生組織或器官提供臨床材料來源，另一方面可以作為研究色素細胞分化發育機制的體外模型.

［1］陳 楨.金魚家化史與品種形成的因素［J］.動物學報，1954，6(2):89－116.

［2］MATSUMOTO J，OBIKA M.Morphological and biochemical characterization of goldfish erythrophores and their pterinosomes［J］.J Cell Biol，1968，39(2):233－250.

［3］MATSUMOTO J.Studies on fine structure and cytochemical properties of erythrophores in swordtail，Xiphophorus helleri，with special reference to their pigment granules(Pterinosomes)［J］.J Cell Biol，1965，27(3):493－504.

［4］OSHIMA N，KASAI A.Iridophores involved in generation of skin color in the zebrafish brachydanio rerio［J］.Forma，2002，17(2):91－101.

［5］RAWLS J F，MELLGREN E M，JOHNSON S L.How the zebrafish gets its stripes［J］.Dev Biol，2001，240(2):301－314.

［6］HULTMAN K A，JOHNSON S L.Differential contribution of direct developing and stem cell－derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern［J］.Dev Biol，2010，337(2):425－431.

［7］GOODRICH H B，MARZULLO C M，BRONSON W H.An analysisof the formation of color patterns in two fresh－water fish［J］.J Exp Zool，1954，125(3):487－505.

［8］TU S，JOHNSON S L.Clonal analyses reveal roles of organ founding stem cells，melanocyte stem cells and melanoblasts in establishment，growth and regeneration of the adult zebrafish fin［J］.Development，2010，137(23):3931－3939.

［9］WONG C E，PARATORE C，DOURS－ZIMMERMANN M T，et al.Neural crest－derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin［J］.J Cell Biol，2006，175(6):1005－1015.

［10］LI L，FUKUNAGA－KALABIS M，YU H，et al.Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes［J］.J Cell Sci，2010，123(6):853－860.

［11］KUNISADA T，YOSHIDA H，YAMAZAKI H，et al.Transgene expression of steel factor in the basal layer of epidermis promotes survival，proliferation，differentiation and migration of melanocyte precursors［J］.Development，1998，125(15):2915－2923.

［12］SCHMIDT ULLRICH R，PAUS R.Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis［J］.Bioessays，2005，27(3):247－261.

［13］LIN S J，FOLEY J，JIANG T X，et al.Topology of feather melanocyte progenitor niche allows complex pigment patterns to emerge［J］.Science，2013，340(6139):1442－1445.

［14］CURRAN K，JAMES A，LISTER B.Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest［J］.Dev Biol，2010，344(1):107－118.

［15］LISTER J A，ROBERTSON C P，LEPAGE T，et al.Nacre encodes a zebrafish microphthalmia－related protein that regulates neural－crest－derived pigment cell fate［J］.Development，1999，126(17):3757－3767.

［16］EMMA R，GREENHILL，ANDREA ROCCO，et al.An iterative genetic and dynamical modelling approach identifies novel features of the gene regulatory network underlying melanocyte development［J］.PLoS Genet，2011，7(9):e1002265.

［17］OSHIMA N，NAKAMARU N，ARAKI S，et al.Comparative analyses of Pigment－aggregating and dispersing actions of MCH on fish chromatophores［J］.Comp Biochem Phys C，2001，129(2):75－84.

［18］GUO H R，BING H，ZHANG S C，et al.Biochemical and histochemical activities of tyrosinase in the skins of normal and albino turbot scophthalmus maximus［J］.Fish Physiol Biochem，2003，29(1):67－76.

［19］GODING C R.Mitf from neural crest to melanoma:signal transduction and transcription in the melanocyte lineage［J］.Gene Dev，2000，14(14):1712－1728.

［20］LEVY C，KHALED M，FISHER D E.MITF master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene［J］.Trends Mol Med，2006，12(9):406－414.

［21］FUSE N，YASUMOTO K，TAKEDA K，et al.Molecular cloning of cDNA encoding a novel microphthalmia－associated transcription factor isoform with a distinct amino－terminus［J］.Biochem J，1999，126(6):1043－1051.

［22］KOLUDROVIC D，DAVIDSON I.MITF，the Janus transcription factor of melanoma［J］.Future Oncol，2013(2):235－244.

［23］OBOKI K，MORII E，KATAOKA T R，et al.Isoforms of mi transcription factor preferentially expressed in cultured mast cells of mice［J］.Bioch Bioph Res Co，2002，290(4):1250－1254.

［24］TASSABEHJI M，NEWTON V E，READ A P.Waardenburg syndrome type 2 caused by mutations in the human microphthalmia(MITF)gene［J］.Nat Genet，1994，8(3):251－255.

［25］ALTSCHMIED J，DELFGAAUW J，WILDE B，et al.Subfunctionalization of duplicate mitf genes associated with differential degeneration of alternative exons in fish［J］.Genetics，2002，161(1):259－267.

［26］LI M，ZHU F，HONG Y，et al.Differential evolution of duplicated medakafish mitf genes［J］.Int J Biol Sci，2013，9(5):496－508.

［27］LI M，ZHU F，HONG N，et al.Alternative transcription generates multiple Mitf isoforms with different expression patterns and activities in medaka［J］.Pigm Cell Melanoma R，2014，27(1):48－58.

［28］FANG D，SETALURI V.Role of microphthalmia transcription factor in regulation of melanocyte differentiation marker TRP－1［J］.Bioch Bioph Res Co，1999，256(3):657－663.

［29］LISTER J A，CAPPER A，ZENG Z，et al.A conditional zebrafish MITF mutation reveals MITF levels are critical for melanoma promotion vs.regressionin vivo［J］.J Invest Dermatol，2014，134(1):133－140.

［30］CURRAN K，LISTER J A，KUNKEL G R，et al.Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest［J］.Dev Biol，2010，344(1):107－118.

［31］KELSH R N，INOUE C，MOMOI A，et al.The tomita collection of medaka pigmentation mutants as a resource for understanding neural crest cell development［J］.Mech Dev，2004，121(7－8):841－859.

［32］SHAKHOVA O，ZINGG D，SCHAEFER S M，et al.Sox10 promotes the formation and maintenance of giant congenital naevi and melanoma［J］.Nat Cell Biol，2012，14(8):882－890.

［33］LAHAV R.Endothelin receptor B is required for the expansion of melanocyte precursors and malignant melanoma［J］.Int J Dev Biol，2005，49(2－3):173－180.

［34］LEE H O，LEVORSE J M，SHIN M K.The endothelin receptor－B is required for the migration of neural crest－derived melanocyte and enteric neuron precursors［J］.Dev Biol，2003，259(1):162－175.

［35］ODENTHAL J，ROSSNAGEL K，HAFFTER P，et al.Mutations affecting xanthophore pigmentation in the zebrafish，Danio rerio［J］.Development，1996，123(1):391－398.

［36］PARICHY D M，RANSOM D G，PAW B，et al.An orthologue of the kit－related gene fms is required for development of neural crest－derived xanthophores and a subpopulation of adult melanocytes in the zebrafish，danio rerio［J］.Development，2000，127(14):3031－3044.

［37］JAMES E，MINCHIN N，SIMON M HUGHES.Sequential actions of Pax3 and Pax7 drive xanthophore development in zebrafish neural crest［J］.Dev Biol，2008，317(2):508－522.

［38］LOPES S S，YANG X，MüLLER J，et al.Leukocyte tyrosine kinase functions in pigment cell development［J］.PLoS Genet，2008，4(3):e1000026.

［39］OHTA S，IMAIZUMI Y，OKADA Y，et al.Generation of human melanocytes from induced pluripotent stem cells［J］.PloS one，2011，6(1):e16182.