鞘氨醇單胞菌USTB-05對微囊藻毒素的生物降解

徐慧敏 ,閆 海 ?,馬 松 ,王華生 ,2,尹春華 ,劉曉璐 (.北京科技大學化學與生物工程學院,北京00083；2.江西理工大學建筑與測繪工程學院,江西 贛州 34000)

鞘氨醇單胞菌USTB-05對微囊藻毒素的生物降解

徐慧敏1,閆 海1?,馬 松1,王華生1,2,尹春華1,劉曉璐1(1.北京科技大學化學與生物工程學院,北京100083；2.江西理工大學建筑與測繪工程學院,江西 贛州 341000)

研究了云南滇池水華藍藻細胞中微囊藻毒素(MCs)的分析和鞘氨醇單胞菌USTB-05在細胞水平和酶水平下對MC-YR、RR和LR的生物降解.結果表明,云南滇池水華藍藻細胞中 MC-YR、RR和 LR的含量分別為 0.16, 0.96, 0.47mg/g.在初始濃度分別為 19.5mg/L MC-YR、79.5mg/L MC-RR和43.6mg/L MC-LR下,鞘氨醇單胞菌USTB-05在2d內可將上述3種MCs全部降解,鞘氨醇單胞菌USTB-05粗酶液可以以更快的速率對 MC-YR、MC-RR和 MC-LR進行高效酶催化降解,在 10h內可以將初始濃度分別為 14.8mg/L MC-YR、28.4mg/L MC-RR和19.5mg/L MC-LR全部降解.同時發現了MC-YR降解過程中的2個中間和1個最終代謝產物.

微囊藻毒素；鞘氨醇單胞菌USTB-05；酶；生物降解

在淡水藍藻水華產生的不同藻毒素中,微囊藻毒素(MCs)是出現頻率最高、產生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素種類,肝臟是其作用的主要靶器官[1-3].MCs是一類化學性質非常穩定的化合物,在300℃高溫下還能維持長時間不分解[4].目前,國內外雖然發現有80多種不同類型的MCs,但在我國主要以MC-RR和MC-LR為主[5-6].

生物降解是目前發現最有效去除MCs的方法,Jones等[7]從天然水體中首次分離出了對MC-LR有降解能力的鞘氨醇單胞菌ACM-3962,隨后 Bourne等[8-9]研究了鞘氨醇單胞菌 MJ-PV酶催化降解 MC-LR的途徑與分子機理,發現至少有4種酶參與了MC-LR的代謝過程.本課題組從云南滇池底泥中成功篩選出了能夠高效降解 MCs的菌株鞘氨醇單胞菌 USTB-05[10],并系統地研究了其降解MCs的動力學過程與優化控制條件[11-13].目前關于MCs生物降解的研究已進入分子水平,降解基因已經成功克隆和表達[14-15],生物降解MC-RR和MC-LR的途徑與分子機理已經基本搞清楚[8,16].關于 MC-YR的研究報道,有優化 MC-YR的高效液相色譜檢測法并對某水庫 MC-YR的污染水平及環境因子進行春、夏、秋、冬 4個季節的監測,分析了水體中微囊藻毒素(MC-YR)質量濃度的季節變化特征及其與水體中總氮、總磷、CODMn和浮游藻類等富營養化指標的相關關系[17-19].也有報道利用二氧化氯氧化方法和紫外-微臭氧工藝去除水體中MC-YR及其氧化機理研究[20-21].但利用生物法高效降解 MC-YR及其降解途徑與分子機理研究方面報道相比較少.

本文在發現云南滇池藍藻細胞不僅產生常見的MC-RR和MC-LR,還發現具有2個苯環結構更復雜的 MC-YR.大多數情況下,一種菌只能降解一種藻毒素,但本研究發現可降解多種藻毒素的菌種,USTB-05不僅能夠降解 MC-RR和MC-LR,而且對MC-YR也具有很強的降解能力.研究了在鞘氨醇單胞菌USTB-05細胞和酶水平生物降解上述3種MCs的動力學過程,旨在為生物法降解MC-YR提供參考.

1 材料與方法

1.1 MCs

標準品 MC-YR(分子式:C52H72N10O13,分子量:1045.19)、MC-RR(分子式:C49H75N13O12,分子量:1038.2)和 MC-LR(分子式:C49H74N10O12,分子量:995.2)均購自美國 Sigma公司,純度＞95%.生物降解實驗所用的 MC-YR、MC-RR和MC-LR采用文獻[22]方法從云南滇池水華藍藻細胞中提取獲得.

1.2 菌種、培養基及培養條件

鞘氨醇單胞菌降解菌株(USTB-05)系本實驗室篩選保存[10],采用文獻[23]的方法培養.

1.3 USTB-05降解MCs的動力學

分別吸取 0.1mL USTB-05菌液接種到含MC-YR、MC-RR和 MC-LR的培養基[24]中;用NaOH和HCl調節初始pH值[25]分別為5.0, 6.0,7.0, 8.0和9.0,研究USTB-05菌在不同pH值下對 MCs的降解效應.實驗在溫度 30℃,搖床轉速200r/min下進行.實驗過程中每12h 取樣,經離心(12000r/min, 10min)后取上清液用 HPLC檢測MCs濃度變化[26].

1.4 酶催化降解MCs

離心(12000r/min,10min)收獲USTB-05細胞,采用文獻[27]方法制備粗酶液(CE).MCs的酶催化降解反應在50mmol/L的磷酸鹽緩沖液體系中進行,條件為溫度 30℃,搖床轉速 200r/min.樣品經12000r/min、10min離心后取上清液在HPLC上測定[26].

2 結果與討論

2.1 MC-YR、MC-RR和MC-LR的提取

圖1 滇池藍藻細胞提取液中MC-YR、MC-RR和MC-LR的HPLC圖譜Fig.1 HPLC Spectrum of Extracted MC-YR, MC-RR and MC-LR from Dianchi cyanobacterial cells

標準品 MC-YR、MC-RR和 MC-LR在HPLC上出峰的保留時間分別為 13.21,6.98,15.89min,滇池藍藻細胞提取液同樣在保留時間13.21,6.98,15.89min左右(圖1)也有對應出峰,其在 200～300nm 的紫外掃描圖譜分別與標準品MC-YR、MC-RR和MC-LR掃描圖譜一致,只是其濃度較低,均在 238nm 左右處有最大吸收峰.另外,通過改變流動相后發現樣品中的 MCs與標準品中3種MCs的出峰時間、掃描吸收峰形和最大吸收峰的波長范圍完全一致.研究結果表明,采集的滇池水華藍藻細胞中所含的化合物是MC-YR、MC-RR和MC-LR3種類型的MCs,其中 MC-RR的含量遠高于 MC-YR和MC-LR.根據 MC-YR、MC-RR和 MC-LR的標準曲線方程計算出藍藻細胞干重中MC-YR、MC-RR和 MC-LR的含量分別為 0.16, 0.96,0.47mg/g,可作為降解底物進行進一步的降解活性研究.因國內外至今尚未研究確定適合不同藻類提取 MCs的最有效提取方法,所以很難確定藻細胞中 MCs的準確含量.目前,我國和世界的各大湖泊水庫的藍藻水華樣品中,發現有MC-RR和 MC-LR的報道較多,而發現有MC-YR的報道相比較少.本研究成功從云南滇池水華藍藻細胞中提取出 MC-YR并定量,為MC-YR的生物降解理論和降解飲用水中MC-YR提供依據.

2.2 USTB-05降解 MC-YR、MC-RR和MC-LR的動力學

在MCs為唯一碳源和氮源條件下,USTB-05在 2d內能夠將初始濃度分別為 19.5,79.5,43.6mg/L的MC-YR、MC-RR和MC-LR全部降解(圖 2),日均降解能力分別為 9.8,39.8,21.8mg/L,說明USTB-05對MCs具有很強的生物降解能力.USTB-05系本課題組篩選的3種菌株中生物降解MCs能力最強的菌株,其第1個降解基因已成功克隆和表達,降解 MC-RR和MC-LR的途徑與分子機理已經基本確定[15,28-29].本研究在對目前國內外研究報道較多的MC-RR和 MC-LR降解的同時,尤其對研究報道還不廣泛的MC-YR進行了高效的生物降解.

圖2 USTB-05降解MCs 的動力學Fig.2 Kinetics of MCs biodegradation by USTB-05

2.3 初始pH值對USTB-05降解MCs的影響

圖3 pH值對USTB-05降解MCs的效應Fig.3 Effects of pH on the biodegradation of MCs by USTB-05

大多數情況下,一種菌只能降解一種藻毒素,但本研究發現可降解多種藻毒素的菌種,USTB-05不僅能夠降解MC-RR和MC-LR,而且對MC-YR也具有很強的降解能力.溫度和pH值是影響USTB-05對MCs降解活性的重要因素,溫度約 30℃,pH值中性或弱堿性,具有高降解活性[30].圖3中,MC-YR、MC-RR和MC-LR的濃度在2d內基本沒有變化,而當初始pH值7.0和8.0時, MC-YR、MC-RR和MC-LR濃度均明顯降低,2d內可基本全部降解,特別是當初始pH值7.0時降解速率更快.采用r檢驗法來驗證該結果是否具有顯著性.初始pH值對MC-YR降解效應,其檢驗顯著水平值 r3,0.01=0.9912＜11.65;初始 pH值對 MC-RR降解效應,其檢驗顯著水平值r3,0.01= 0.9912＜6.08;初始pH值對MC-LR降解效應,其檢驗顯著水平值 r3,0.01=0.9912＜12.73.所以認為初始pH值對USTB-05降解3種MCs效應都具有顯著性影響,且置信度為95%.

本研究結果說明,該菌在降解MCs過程中對環境的酸堿度有一定要求,中偏堿性條件更適合MCs的生物降解,這和已報道的幾株MCs降解細菌相似.假單胞菌M-6的胞內粗酶受pH值影響顯著,在pH6～8中性范圍內降解MC-LR速率較快[31],此報道與本研究結果相似,說明 USTB-05降解MCs對pH值變化比較敏感,在稍偏堿性條件下活性較高(圖3).藍藻水華發生的水體上層因藍藻的光合活性 pH值呈較強堿性[32-33],而在處理池中藻水混合物 pH值相對較低,一般在6.9～8.5,這與USTB-05對MCs高降解活性的pH值區間大致是相吻合的,因此藍藻死亡裂解后釋放的MCs可以被更快速降解.本研究結果也顯示在pH值較高(＞9)的水體暴發藍藻水華時,其產生的MCs不易發生生物降解,這也是造成MCs積累引起危害的重要原因之一.

2.4 USTB-05酶促MCs降解反應動力學

圖4 USTB-05酶催化降解MCs的動力學Fig.4 Biodegradation kinetics of MCs catalyzed by enzymes of USTB-05

利用USTB-05菌粗酶液對標準品MC-YR、MC-RR和MC-LR進行酶催化降解,發現在10h內可將初始濃度分別為14.8,28.4,19.5mg/L的標準品MC-YR、MC-RR和MC-LR全部降解(圖4),與USTB-05細胞水平 (圖2)相比具有更強的降解能力.酶催化降解是高效去除 MC-RR和MC-LR2種MCs的有效途徑之一[16,27],本研究發現,USTB-05粗酶液同樣可以高效降解結構更復雜帶有 2個苯環的 MC-YR.因此可直接采用微生物酶作為一種可生長或不可生長的生物催化劑,通過投加達到高效去除 MCs污染的目的,這可能是進行原位生物修復高效去除飲用水源地中MCs的優化控制方法.

2.5 USTB-05菌酶催化降解MC-YR

圖 5中,初始時只有在保留時間 12.4min的MC-YR出峰,反應 1.5h MC-YR峰高明顯降低,說明 USTB-05酶中存在能夠催化代謝 MC-YR的酶,另外在保留時間 5.5, 9.2min處分別出現了產物 1和產物 2的出峰.進一步延長反應時間到3h,發現MC-YR峰消失,產物1峰降低,但在保留時間12.1min處出現了產物3的出峰.反應3～24h,產物1和2的峰高逐漸降低并消失,而產物3的峰高逐漸增加.Bourne等[8,27]對鞘氨醇單胞菌的MC-LR和MC-RR降解途徑進行了研究,首先第1個酶打開連接Adda與精氨酸之間的肽鍵,催化環狀MC-LR和MC-RR變成線狀的MC-LR和MC-RR;然后第 2個酶進一步斷裂線型 MC-LR和MC-RR肽鏈上丙氨酸與亮氨酸的肽鍵,生成四肽化合物;再經第 3個酶降解為小分子多肽和氨基酸.并證明了這 3種代謝產物的毒性明顯低于MC-LR和MC-RR本身,降解過程是一個解毒的過程.本研究結果與Bourne等的研究結果相似,說明USTB-05同樣至少有3種酶參與了MC-YR的催化降解反應,出現了3個降解產物,其中產物1和 2分別是由第 1個酶和第 2個酶催化降解MC-YR產生的中間代謝產物,而產物3為第3個酶催化降解MC-YR產生的最終產物.3種代謝產物結構正在進一步的研究和測定中.

本課題組曾經分別研究USTB-05酶催化降解MC-RR和MC-LR,分別觀察到了2個中間代謝產物和 1個最終產物[27,34],與本研究的結果基本一致,說明 USTB-05很可能以類似的途徑對MC-YR進行生物降解.盡管國內外在MC-RR和MC-LR降解途徑與分子機理方面有很多研究報道[8,15,28-29],但對于結構更為復雜的MC-YR的生物降解途徑的文獻相對較少.本研究發現,我國云南滇池水華藍藻中存在MC-YR,在USTB-05生物降解MC-YR產物結構鑒定、基因克隆表達、降解途徑與分子機理方面還需進一步研究.

圖5 USTB-05粗酶催化降解MC-YR的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of the enzymatic biodegradation of MC-YR by the crude enzymes of USTB-05

3 結論

3.1 采自云南滇池的藻樣細胞中 MC-YR、MC-RR和 MC-LR的含量分別為 0.16, 0.96,0.47mg/g.

3.2 在初始濃度分別為 19.5mg/L MC-YR、79.5mg/L MC-RR和43.6mg/L MC-LR下,鞘氨醇單胞菌USTB-05在2d內可將上述3種MCs全部降解.鞘氨醇單胞菌USTB-05粗酶液可以以更快的速率對標準品 MC-YR、MC-RR和MC-LR進行高效酶催化降解,在10h內可以將初始濃度分別為 14.8mg/L MC-YR、28.4mg/L MC-RR和19.5mg/L MC-LR全部降解.當pH 值7.0和8.0中性偏堿時,降解酶活性較高.

3.3 在USTB-05酶催化降解MC-YR過程中,發現2個中間和1個最終代謝產物.

[1] Honkanen R E, Zwiller J, Moore R E, et al. Characterization of microcystin-LR, a potent inhibitor of type 1and 2a protein phosphatases [J]. Biological Chemistry, 1990,265:1940-1944.

[2] 楊曉紅,蒲朝文,張仁平,等.水體微囊藻毒素污染對人群的非致癌健康風險 [J]. 中國環境科學, 2013,33(1):181-185.

[3] 王偉琴,金永堂,吳 斌,等.水源水中微囊藻毒素的遺傳毒性和健康風險評價 [J]. 中國環境科學, 2010,30(4):468-476.

[4] Duy T N, LamP K S, Shaw G R, et al. Toxicology and risk assessment of fresh water cyanobacterial (Blue-green Algae)toxins in water [J]. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 2000,163(3):113-186.

[5] Matthiensen A, Beattie K A, Yunes J S, et al. Microcystin-LR,from the cyanobacterium microcystis RST 9501and from a microcystis bloom in tne patos lagoon Estuary [J]. Brazil.Phytochemistry, 2000,55(4):383-387.

[6] 周宏敏,歐惠超,任 鵬,等.利用 SPR技術測定湖水中微囊藻毒素 [J]. 中國環境科學, 2012,32(7):1284-1287.

[7] Jones G J, Bourne D G, Blakeley R L, et al. Degradation of the cyanobacterial hepatotoxin microcystin by aquatic bacteria [J].Natural Toxins, 1994,2(4):228-235.

[8] Bourne D G, Jones G J, Blakeley R L, et al. Enzymatic pathway for the bacterial degradation of the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin LR [J]. Applied and Environ. Microbiology,1996,62(11):4068-4094.

[9] 袁 媛,吳 涓,李玉成,等.活性炭纖維固定化菌對微囊藻毒素MC-LR的去除研究 [J]. 中國環境科學, 2014,34(2):403-409.

[10] Wang J F, Wu P F, Chen J, et al. Biodegradation of Microcystin-RR by a New Isolated Sphingopyxis sp. USTB-05 [J]. Chinese Journal of Chemical Engineering, 2010,1(18):108-112.

[11] Xiao C B, Yan H, Wang J F, et al. Microcystin-LR biodegradation by Sphingopyxis sp. USTB-05 [J]. Frontiers of Environmental Science, and Engneering in China, 2011,5(4):526-532.

[12] Zhang M L, Pan G, Yan H. Microbial biodegradation of microcystin-RR by bacterium Sphingopyxis sp. USTB-05 [J].Journal of Environmental Sciences, 2010,22(2):168-175.

[13] Yan H, Wang J F, Chen J, et al. Biodegradation of Microcystin-RR extracted from cyanobacterial blooms by Sphingopyxis sp. USTB-05 [R]. Second International Conference on Digital Manufacturing and Automation, 2011.

[14] Kazuya Shimizu, Hideaki Maseda, Kunihiro Okano, et al.Enzymatic pathway for biodegrading microcystin LR in Sphingopyxis sp. C-1 [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012,114(6):630-634.

[15] Yan H, Wang J F, Chen J, et al. Characterization of the first step involved in enzymatic pathway for microcystin-RR biodegraded by Sphingopyxis sp. USTB-05 [J]. Chemosphere, 2012,87(1):12-18.

[16] 閆 海,張 超,魏 巍,等.微囊藻毒素生物降解的研究進展[J]. 環境工程學報, 2007,1(10):8-12.

[17] 朱美潔.水庫型水源地微囊藻毒素污染現狀及環境影響因素研究一以山仔水庫為例 [D]. 福州:福建師范大學, 2008.

[18] 高振美,趙中華,張 波,等.太湖梅梁灣水體微囊藻毒素含量的季節變化特征及其影響因素研究 [J]. 生態環境學報, 2011,20(6/7):1063-1067.

[19] 朱光燦.飲用水中微囊藻毒素降解機理與去除技術研究 [D].南京:河海大學, 2004.

[20] 季 穎.二氧化氯去除水中微囊藻毒素及氧化動力學的研究[D]. 哈爾濱:哈爾濱工業大學, 2007.

[21] 朱光燦,呂錫武.紫外一微臭氧工藝降解微囊藻毒素的動力學特性 [J]. 東南大學學報, 2005,35(3):438-411.

[22] 閆 海,潘 綱,張明明,等.微囊藻毒素的提取和提純研究 [J].環境科學學報, 2004,24(2):355-359.

[23] 徐春霞,何宏勝,張 超,等.高效降解微囊藻毒素食酸戴爾福特菌USTB-04的培養和活性研究 [J]. 環境工程學報, 2007,1(5):21-24.

[24] 閆 海,鄧義敏,鄒 華,等.降解微囊藻毒素菌種的篩選和活性研究 [J]. 環境科學學報, 2004,25(6):49-53.

[25] 吳 涓,鐘 升,王光云,等.一株降解微囊藻毒素菌種的鑒定及其活性研究 [J]. 中國環境科學, 2011,31(1):116-122.

[26] 周 潔,何宏勝,閆 海,等.滇池底泥微生物菌群對微囊藻毒素的生物降解 [J]. 環境污染治理技術與設備, 2006,7(4):30-34.

[27] 何宏勝,閆 海,周 潔,等.篩選菌種酶催化降解微囊藻毒素的特點 [J]. 環境科學, 2006,27(6):1171-1175.

[28] Wang H S, Yan H, Liu X L, et al. First Step in the Biodegradation of Microcystins by Sphingopyxis sp. USTB-05 [J]. Advanced Materials Research, 2013,647:338-343.

[29] Yan H, Wang H S, Wang J F, et al. Cloning and expression of the first gene for biodegrading microcystin LR by Sphingopyxis sp.USTB-05 [J]. Journal of Environmental Sciences, 2012,24(10):1816-1822.

[30] 金麗娜,張維昊,鄭 利,等.滇池水環境中微囊藻毒素的生物降解 [J]. 中國環境科學, 2002,22(2):189-192.

[31] 苑寶玲,陳彩云,李云琴,等.假單胞菌胞內酶粗酶提液對微囊藻毒素MC-LR的降解 [J]. 環境化學, 2009,28(6):854-858.

[32] Soumaya El Herry, Afef Fathalli, Amel Jenhani-Ben Rejeb, et al.Seasonal occurrence and toxicity of Microcystis spp. and Oscillatoria tenuis in the Lebna Dam, Tunisia [J]. Water Research,2008,42(4/5):1263-1273.

[33] 趙 爽,陳 偉,左艷霞,等.藍藻水華堆積處理池中微囊藻毒素降解細菌的分離及降解特性 [J]. 水生生物學報, 2013,37(3):522-529.

[34] 閆 海.微囊藻毒素的產生與生物降解 [D]. 北京:中國科學院研究生院, 2002.

Biodegradation of microcystins by Sphingopyxis sp. USTB-05.

XU Hui-min1, YAN Hai1?, MA Song1, WANG Hua-sheng1,2, YIN Chun-hua1, LIU Xiao-lu1
(1.School of Chemistry and Biological Engineering, University of Science and Technology, Beijing 100083, China；2.School of Architectural and Surveying and Mapping Engineering, Jiangxi University of Science and Technology, Ganzhou 341000, China). China Environmental Science, 2014,34(5)：1316～1321

The contents of microcystins (MCs) in dry cyanobacterial cells taken from Dianchi Lake and the biodegradation of MC-YR, RR and LR by Sphingopyxis sp. USTB-05 at the cellular and enzyme levels were studied. The contents of MC-YR, RR and LR in dry cyanobacterial cells were 0.16, 0.96 and 0.47mg/g, respectively. Initial concentrations of 19.5mg/L MC-YR, 79.5mg/L MC-RR and 43.6mg/L MC-LR were completely biodegraded by Sphingopyxis sp. USTB-05 within 2d. Further studies indicated that MC-YR, RR and LR could also be biodegraded in more rapid rates by crude enzymes of Sphingopyxis sp. USTB-05, and initial MC-YR, RR and LR of 14.8, 28.4, 19.5mg/L were completely removed within 10h, respectively, and two intermediate and one final products were found during the biodegradation process of MC-YR catalyzed by the crude enzymes of USTB-05.

microcystins；Sphingopyxis sp. USTB-05；enzyme；biodegradation

X172

A

1000-6923(2014)05-1316-06

2013-09-12

國家自然科學基金資助項目(21177009,11071013);教育部博士點基金資助項目(20120006110001)

? 責任作者, 教授, haiyan@ustb.edu.cn

徐慧敏(1989-),女,內蒙古包頭人,北京科技大學碩士研究生,主要從事微囊藻毒素的生物降解研究.