識別杜洛克豬個體身份的DNA 條形碼

丁 潛， 邢光東， 胡肄農， 紀紅軍， 趙慶順， 徐銀學

(1.南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京210095;2.江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京210014;3.江蘇省農業科學院獸醫研究所，江蘇 南京210014;4.南京大學模式動物研究所，江蘇 南京210061)

豬個體身份識別在豬場管理、豬肉產品溯源等方面意義重要。技術簡單、成本低廉且操作簡單的耳標等傳統方法仍是豬場的主要個體識別方法，但應用中存在易損、易脫落丟失、易混淆等缺陷?；趥鹘y方法的不足，近年來DNA 個體鑒定方法，包括微衛星標記、SNP 標記等在內的個體鑒定方法成為研究熱點［1-3］，但仍無法得到實際應用。針對以上情況，我們依據NCBI 數據庫中已登錄的SNP 相關信息［4］，設計并篩選可有效且特異進行PCR 擴增的引物對，以獲得高雜合度SNP 位點，用于豬個體身份DNA 條形碼及相應的數字條形碼編制，實現豬個體身份的DNA 識別。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及基因組DNA 模板制備

68 頭杜洛克(Duroc)豬的耳組織樣采自杭州大觀山種豬場，-20 ℃冷凍保存備用。基因組DNA模板用DNA Mini Extract 試劑盒(南京潤邦生物技術有限公司產品)制備，具體制備過程如下(單個樣本):小米粒大小(1 mm3左右)耳組織放入裝有17.6 μl DNA Mini Extract (A、B 液混合而成)的PCR 管中，PCR 儀中95 ℃5 min，16 ℃1 min(在此過程中暫停PCR 儀，加入10 mg/ml蛋白酶K 2.4 μl)，55 ℃2 h，95 ℃10 min，16 ℃1 min，離心取上清或上清混合成模板作PCR 模板。

1.2 引物設計、PCR 反應、測序

根據NCBI 登錄的豬基因組序列，共設計31 對引物，其中8 對引物的混合樣本PCR 產物電泳條帶單一，直接測序峰圖背景干凈易讀且包含1 個或多個套峰，并獲得H≥0.10 的SNP 位點(表1、表2)。引物擴增的PCR 體系(20 μl)為:樣品基因組DNA模板1 μl，正反引物各1 μl，超純水7 μl，2 × PCR Master Mix 10 μl。反應條件為:95 ℃先變性2 min;95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35 個循環;72 ℃最后延伸10 min。各引物對的退火溫度和延伸時間見表1。PCR 擴增產物測序結果用Vector NTI Advance 11 軟件比對，并結合分析測序峰圖，以篩選SNP 位點。

表1 篩選的8 對引物相關信息及其退火溫度和延伸時間Table 1 Information of 8 primer pairs and their annealing temperatures and extending times for PCR reactions

1.3 SNP 連鎖不平衡分析和雜合度計算

基因的同一條染色體或擴增片段SNP 位點之間存在關聯性，即SNP 位點連鎖不平衡(Linkage disequilibrium，LD)現象。根據68 個杜洛克個體的擴增片段測序結果，對獲得的39 個SNP 位點的關聯性進行分析。剔除完全關聯的SNP 位點，并過濾雜合度小于0.10 的SNP 位點，根據剩余的16 個SNP 位點，對擴增片段進行基因分型。

雜合度反映一個位點具有2 個以上等位基因的期望值。雜合度小的SNP 位點出現單一純合基因型的概率較大，用于個體識別的意義也相對較小。為了使研發的DNA 個體身份識別技術更有效，選用雜合度H≥0.10 的SNP 位點。雜合度值的計算公式如下:

式中，H是雜合度值，Pi是每個SNP 的等位基因頻率，n是等位基因的數目。

1.4 豬個體身份識別的SNP 條形碼及相對應的數字條形碼編制

8 對引物擴增的有效SNP 位點共計39 個，經連鎖不平衡分析及雜合度計算，最終確定16 個SNP位點用于杜洛克豬個體身份識別的條形碼編制。SNP 條形碼中SNP 位點的排列，以引物對1 ～8 的次序依次排列(其中每對引物的SNP 位點以5'-至3'-順序依次排列)，組合成SNP 條形碼。其中SNP位點以每對引物擴增產物(正向引物)的第1 個堿基所在位置計為+1 進行標識。每個SNP 位點可形成AA、TT、GG、CC、AT、AG、AC、TG、TC、GC 10 種基因型，當依次分別用數字0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 共10 個數字替代時，每個個體不同SNP 位點的基因型就轉換為相應的數字SNP 條形碼。

2 結果與分析

2.1 SNP 雜合度篩選及連鎖不平衡分析

8 對引物擴增68 頭杜洛克豬基因組DNA 樣并測序，共獲得39 個SNP 位點(表2)。經SNP 位點連鎖不平衡分析及雜合度篩選(H≥0.10)，最終選留16 個SNP 位點用于杜洛克豬的個體身份識別(表2)。剔除的23 個SNP 位點，或與選留的SNP位點完全連鎖，或其雜合度H＜0.10。雖然雜合度H＜0.10 的SNP 位點也能夠與其他SNP 位點一起組成數量極少的基因型，但是因為雜合度過低，在繁育過程中容易產生單一純合子而在后代中丟失多態性，在個體識別中意義不大。

表2 8 對引物在杜洛克豬中獲得的39 個SNP 位點Table 2 The 39 SNP loci obtained by 8 PCR primer pairs in Duroc pigs

2.2 SNP 條形碼及數字條形碼編制

選留的16 個H≥0.10 的SNP 位點用于杜洛克豬個體身份識別條形碼編制。在豬個體識別中，同窩豬樣品的個體識別理論上是最困難的，試驗中能夠完全區分的68 個樣品來自10 窩豬，而由這16 個SNP 組成的基因型能夠在68 頭杜洛克豬中，完全區分每個個體，實現個體識別(表3)。

表3 編制的用于個體身份識別的部分杜洛克豬SNP 條形碼及相應的數字條形碼Table 3 SNP and their corresponding digital barcodes of some of the Duroc pigs used for individual identification

3 討論

3.1 豬個體身份識別

傳統的耳標等豬個體識別技術［5］，一旦與肉產品分離就會失去作用，而基因標記技術可以彌補這一缺陷［6］。基因標記技術將成為新一代的溯源或個體識別標記技術。在基因標記技術中，SNP 標記被公認為最具有潛在的實際應用價值。豬共有18對常染色體，每個SNP 位點存在3 種基因型，如果每對染色體僅篩選、利用1 個雜合度高的SNP 位點，那么理論上18 個SNP 位點就可以組成近4 億(318=387 420 489)種基因型。實際上每條染色體上可利用的SNP 位點很多(1 對引物可同時擴增出多個SNP 位點，且可組成多種可利用的基因型)，篩選SNP 位點并用于豬的個體身份識別是可行的。本研究篩選的8 對引物擴增片段中組成的基因型分別有2、10、9、3、3、9、3、3 種，理論上可以用于131 220(2 ×10 ×9 ×3 ×3 ×9 ×3 ×3)頭豬的個體身份識別，試驗中也很好地區分了所采集的68 頭豬的樣品。

3.2 混樣PCR 擴增篩選SNP 位點

在NCBI 公共數據庫中獲得的候選SNP 被用到遺傳學研究中之前，這些SNP 的驗證和其等位基因頻率的估計是必須的［7］。而對這些SNP 的等位基因頻率估算，需要大量且相關度低的樣品，成本很高［8］。通過混合等量個體DNA 樣品形成混樣來檢測等位基因頻率，高效且廉價，能夠大大地減少DNA 的用量及分析費用［7］。這是本試驗選擇使用混合模板的原因。

我們先通過混樣PCR 產物測序，粗略檢測SNP位點存在情況，再由每個個體的SNP 位點檢測，最終確定1 對引物所擴增的片段是否含有多個SNP位點存在?；鞓覲CR 產物測序時會出現套峰，無論是個別優勢模板PCR 的結果，或是部分模板PCR產物混合的結果，都能在一定程度上說明套峰出現位置存在SNP 位點。在混樣測序的結果中，有3 處套峰都說明該處存在SNP，+502 處雖然在單個樣品測序中發現了SNP，但在混合樣品測序中并沒有發現，查找其對應的雜合度可知，+502 處的雜合度為0.13，較其他3 處0.37 低了很多。說明混樣測序中套峰的出現，在一定程度上表明該處存在SNP 且雜合度較高。

3.3 SNP 位點的連鎖不平衡分析及雜合度篩選

SNP 位點連鎖不平衡，是指同一條染色體上，2個SNP 位點間的非隨機相關，即位于同一條染色體的2 個SNP 位點同時存在的概率，大于群體中因隨機分布而同時出現的概率。2 個SNP 位點完全連鎖不平衡時，這2 個SNP 位點組成的單體型只有2種，在用作個體身份識別時2 個一起的效果和單獨一個是相同的，這樣的SNP 位點只取其一即可。本試驗中引物對3 共獲得9 個SNP 位點，其中+470、+499 和+530 這3 個SNP 所組成的基因型只有TTTTTT、CCGGCC 和TCTGTC 這3 種，在其余65 個樣品中這3 個SNP 也只能組成該3 種基因型。說明在該群體中，若排除新的SNP 出現，則+470、+499 和+530 這3 個SNP 只有TTT 和CGC 這2 種單體型，SNP 完全關聯，所以+470、+499 和+530 這3 個SNP 中取+470 一個用作個體鑒定即可。而+502 位置和+ 470 位置的SNP 共可組成TCCC、TCTC、TTCC、CCCC 4 種基因型，推斷這2 個位置有TC、CC、TT 這3 種單體型，SNP 沒有完全關聯，所以+470 和+502 都可用于個體識別。8 對引物擴增的SNP 位點經過連鎖不平衡分析，完全連鎖的SNP位點都只保留一個。其中，雖然引物對2 和引物對3 在同一條染色體上，但這2 對引物所擴增的片段在染色體上相距約9 Mbp，擴增的SNP 位點之間沒有發現完全的連鎖不平衡。雜合度過低(H＜0.10)的SNP 位點對于個體識別的意義不大，編碼SNP 條形碼和對應的數字條形碼時，予以舍棄。

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