基于金納米顆粒的比色法檢測大腸桿菌O157∶ H7

周麗霞， 肖 勇， 楊耀東

(中國熱帶農業科學院椰子研究所，海南省熱帶油料作物生物學重點實驗室，海南 文昌571339)

大腸桿菌(Escherichia coli)O157∶ H7 屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，是一種毒性較強的食源性病原菌，主要通過飲用水、牛奶等食品進行傳播［1-5］，人體感染該類病原菌會患有腹瀉、出血性結腸炎等疾病，此外還可引發溶血性尿毒綜合癥及血栓性血小板減少紫斑等嚴重并發癥，嚴重者可導致死亡［6-7］。因此，快速、靈敏的檢測和分析此類感染性病原菌對于疾病防治、環境保護等都具有十分重要的意義。傳統的病原菌檢測方法通常建立在免疫學和細菌分離的基礎上，如細胞計數法、酶聯免疫吸附法、PCR 分析法等，該類方法具有較高的準確度，但也存在很多缺點，如細菌培養費時，檢測不靈敏，分離過程中造成菌數目的損失等［8-10］。因此，傳統的檢測方法已遠不能滿足現代生活和醫學應用中對大腸桿菌O157∶ H7 快速靈敏檢測的要求，探索一種快速、靈敏、低成本和易操作的病原菌檢測新方法對于預防疾病傳播和環境保護都具有深遠的意義。

隨著納米科技與生物學的深入發展，金納米顆粒作為納米材料的重要成員之一，其在量子尺寸效應、光穩定性和生物相容性等方面的獨特優勢，已在微生物和細胞檢測領域得到了廣泛應用［11］。本試驗利用抗體功能化金納米顆粒與大腸桿菌之間的聚合，發展了一種基于金納米顆粒的比色法，并用此方法分別對緩沖液體系和礦泉水中大腸桿菌O157∶H7 進行快速檢測，以期為多種食源性病原菌的快速、靈敏檢測提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HAuCl4購于天津市化學試劑研究所;檸檬酸三鈉購于天津市化學試劑一廠;多克隆羊抗大腸桿菌O157∶ H7 抗體、溶菌肉湯(LB)培養基、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC·HCl)購于北京鼎國生物科技有限公司;E.coliO157∶ H7 購于廣州環凱生物科技有限公司;E.coliO149 購于廣東省微生物研究所;E.coliDH5α 購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

JEOL-1230 型透射電子顯微鏡購自日本JEOL公司;高速離心機購于日本Hitachi 公司;納米粒度及Zeta 電位儀(Nano-ZS)購于英國Malvern 公司;Lambda 900UV 光譜儀購自Perkin Elmer 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 金納米顆粒的制備、生物修飾及表征 參照文獻［12］報道的方法制備金納米顆粒，在100 ml 的燒杯中，加入濃度為0.01%的氯金酸50 ml，加熱攪拌至沸騰后，加入濃度為1.00%的檸檬酸三鈉2 ml，繼續保持沸騰并反應15 min，溶液顏色變為酒紅色，停止加熱并使其自然冷卻至室溫，即合成了金納米顆粒。

參照文獻［13］、［14］方法進行納米顆粒的生物修飾。取1 ml 金納米顆粒溶液，離心后去掉上清液，向體系中加入10 μl 巰基丙酸，輕輕混勻后室溫下放置4 d，高速離心后用pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，然后將顆粒分散在1 ml PBS 中。向體系中加入3.5 mgNHS，于25 ℃下反應30 min，再加入50 μl 1 mg/ml 的多克隆羊抗大腸桿菌O157∶ H7抗體和3.5 mg EDC·HCl，于25 ℃下反應3 h，待反應終止后離心除去上清液，然后分散在PBS 緩沖液中，并避光于4 ℃保存。采用納米粒度儀及Zeta 電位儀、透射電鏡和紫外吸收對修飾前后的顆粒進行表征［15］。

1.2.2E.coliO157∶ H7 的培養 將含有0.5 g 酵母提取物、1.0 g 蛋白胨和0.5 g NaCl 的LB 培養基粉末溶于100 ml 水中，于121 ℃下高溫滅菌30 min［16］。分別將E.coliO157∶ H7、E.coliO149 和E.coliDH5α 在液體培養基中于37 ℃培養2.5 ～3.0 h，用涂板計數法計算初始菌濃度，并將培養好的菌懸液放在4 ℃保存。

1.2.3E.coliO157∶ H7 的檢測 將1 ml 6.3 ×106個E.coliO157∶ H7 菌懸液8 000 r/min離心5 min，去除上清液后，加入1 ml pH 為7.4 的PBS 緩沖液沖洗2 次，并最終將菌充分分散在1 ml PBS 緩沖液中。根據梯度濃度稀釋法，得到濃度為1 ml 6.3 ×101～6.3 ×106個菌懸液。

分別取100 μl 終濃度為9.3 mg/ml的抗體功能化金納米顆粒，加入400 μl 上述不同濃度的菌懸液，于37 ℃恒溫培養箱中孵育1 h。根據抗原-抗體的免疫特異性結合，原本分散的金納米顆粒集中聚合在菌的表面，根據金納米顆粒的尺寸效應，使得混合體系的顏色發生變化。由于緩沖液中目標菌的濃度不同，顆粒的聚合程度也不同，混合體系的顏色也逐漸由紅色變為藍色，從而實現了對大腸桿菌O157∶ H7快速、直觀地檢測。

1.2.4 食品中大腸桿菌O157∶ H7 的檢測 為考察該檢測方法的實用性，從當地超市買了瓶裝礦泉水，人為加入目標菌后直接使用。將1 ml 4.1×106個E.coliO157∶ H7 菌懸液8 000 r/min離心5 min，去除上清液后，加入1 ml 礦泉水沖洗2 次，并最終將菌充分分散在1 ml 礦泉水中。根據梯度濃度稀釋法，得到濃度為1 ml 4.1×101～4.1×106個菌懸液。

2 結果與分析

2.1 金納米顆粒的表征

合成的金納米顆粒形貌如圖1 所示，顆粒呈規則的球形，大小均勻且分散性較好，另外，納米粒度儀測定出金納米顆粒的平均直徑約為(12.3 ±2.0)nm，該結果與電鏡圖的大小基本吻合，有利于顆粒的下一步應用。圖2 為金納米顆粒修飾巰基丙酸前后的吸收光譜，測得其最大熒光發射峰位于520 nm左右。當顆粒表面修飾了巰基丙酸后，表面有大量的羧基基團，其電位約為-44.7 mV(圖3)，這一結果表明，顆粒表面成功地修飾了大量巰基丙酸。

圖1 金納米顆粒的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopic(TEM)image of gold nanoparticles

圖2 金納米顆粒修飾前后的吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectrum of gold nanoparticles and modified gold nanoparticles

圖3 羧基化金納米顆粒的Zeta 電位圖Fig.3 Zeta potential spectrum of carboxyl modified nanoparticles

2.2 大腸桿菌O157∶ H7 的檢測

2.2.1 可行性考察 基于金納米顆粒的比色法對1 ml 6.3 ×105個大腸桿菌純培養物陽性對照和陰性對照(陰性對照1:以無菌緩沖液取代大腸桿菌O157∶ H7;陰性對照2:以裸金納米顆粒取代功能化金納米顆粒)進行可行性考察。結果顯示，在陽性對照組中，抗體功能化金納米顆粒與目標菌共孵育后，體系顏色變為藍色，而在2 個陰性對照中，體系顏色仍為紅色，幾乎沒有發生顏色變化，這一結果說明該方法檢測大腸桿菌O157∶ H7 是可行的，同時表明抗體與金納米顆粒的交聯效果較好。

2.2.2 大腸桿菌O157∶ H7 的檢測結果 基于金納米顆粒的比色法對梯度濃度為1 ml 6.3 ×101～6.3 ×106個大腸桿菌O157∶ H7 進行檢測，通過溶液顏色的變化，來考察方法的檢測靈敏度。結果顯示，當菌液濃度為1 ml 6.3 ×102個時，體系顏色由紅色變為紫色，隨著菌濃度的增大，顏色逐漸變為藍色，因此，該方法檢測下限為1 ml 6.3 ×102個大腸桿菌O157∶ H7。為進一步驗證這一結果，取適量濃度為1 ml 6.3 ×103個大腸桿菌O157∶ H7 與功能化金納米顆粒的混合液滴在銅網上，室溫下放置24 h 陰干，在透射電鏡下觀察金納米顆粒與大腸桿菌O157∶ H7的形態(圖4)，發現大腸桿菌O157∶ H7表面成功聚集了一定量的金納米顆粒。

圖4 金納米顆粒與大腸桿菌O157∶ H7 的透射電鏡圖Fig.4 TEM image of the mixture of E.coli O157 ∶ H7 and gold nanoparticles

2.3 檢測方法的特異性考察

為進一步評價該檢測方法的特異性，現分別采用E.coliDH5α(1 ml 5.7 ×105個)和E.coliO149(1 ml 7.2 × 105個)作為非目標菌，與大腸桿菌O157∶ H7經過同樣的處理方法后，加入抗體功能化金納米顆粒，并于37 ℃恒溫孵育1 h。考察結果顯示，當分別采用無菌緩沖液、E.coliO149、E.coliDH5α 代替目標菌(E.coliO157∶ H7)時，體系顏色均未發生變化，而加入大腸桿菌O157∶ H7 時，體系顏色從紅色變為藍色，由此可見，該方法的檢測特異性較好。同時，我們測定了每個體系的紫外吸收光譜，如圖5 所示，當體系中加入大腸桿菌O157∶ H7時，金納米顆粒520 nm 吸收峰降低，隨著顆粒的聚集程度增大，在630 nm 出現新的吸收峰。表明只有大腸桿菌O157∶ H7 誘導金納米顆粒聚集，而其他非目標菌未與功能化顆粒結合，這一結果進一步證明該方法具有較好的檢測特異性，未出現抗體與非目標菌的交叉反應。

圖5 不同菌存在時金納米顆粒的吸收光譜Fig.5 Absorption spectra of gold nanoparticles in the presence of different bacteria

2.4 食品中大腸桿菌O157∶ H 7 的檢測

為證明基于金納米顆粒的比色法可用于檢測食品中的大腸桿菌O157∶ H7，用礦泉水配制了400 μl終濃度為1 ml 4.1 × 101～4.1 × 106個大腸桿菌O157∶ H7，并分別加入100 μl 抗體功能化的金納米顆粒，于37 ℃恒溫中孵育1 h。結果顯示，當菌濃度為1 ml 4.1 ×102個時，體系顏色由紅色變為紫色，隨著菌濃度的增大，體系顏色逐漸變為藍色。為進一步證明該檢測方法的靈敏度，分別對1 ml 4.1 ×101個和1 ml 4.1 ×102個菌濃度的反應體系進行光譜分析，結果(圖6)顯示，1 ml 4.1 ×101個菌濃度的反應體系在520 nm 有吸收峰，630 nm 處無鋒，而1 ml 4.1 ×102個菌濃度的反應體系在520 nm的吸收峰降低，隨著顆粒的聚集程度增大，在630 nm 出現新的吸收峰。表明應用該比色法對礦泉水樣本進行檢測，其靈敏度為1 ml 4.1 ×102個 大腸桿菌O157∶ H7。

圖6 不同濃度大腸桿菌O157∶ H7 存在時金納米顆粒的吸收光譜Fig.6 Absorption spectra of gold nanoparticles in the presence of different concentrations of E.coli

3 結論

基于抗體功能化的金納米顆粒，發展了一種直觀、簡便的比色分析法用于大腸桿菌O157∶ H7 的檢測。該方法巧妙的運用了金納米顆粒的量子尺寸效應，由于聚集程度不同，其吸收光譜發生紅移，從而引起溶液顏色發生不同的變化，實現了對緩沖體系和礦泉水中目標菌的快速檢測。若采用針對其他病原菌以及細胞的特異性抗體，有望成為一種通用的方法用于食品檢測、疾病診斷和環境保護等領域中多種病原菌與細胞的測定與分析。

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