6 種野生觀賞蕨無菌培養體系的建立

秦 波，林 茂，黃 欣，孫開道，李 冰，唐 慶，王華新，李進華

（廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西 南寧 530002）

觀賞蕨有“無花之美”之稱，其以飄逸優美的株型、翠綠精致的葉片吸人眼球，既可露地栽植用于園林綠化美化，又可做成盆栽商品或通過簡單加工做成切葉產品，是觀葉植物產業的重要組成部分[1-2]。中國蕨類資源豐富，達2 600 種以上，約占全世界的21.67%，但尚未得到有效的開發和利用[3]。據研究報道，當前我國的商品觀賞蕨類品種單一，來源主要依靠野外采挖和國外進口。野外采挖及國外進口不僅生產成本高，而且不利于產業的長久持續發展。造成當前局面的原因主要是國內觀賞蕨的繁殖技術不成熟，難以滿足產業發展要求[4]。

露地栽植蕨類一般采用孢子繁殖和分株繁殖。孢子繁殖具有繁殖系數高、孢子易獲得的優勢，但容易受外界環境因子影響；分株繁殖的繁殖系數較低，且同樣易受外界環境的影響[5]。無菌培養是一種快速有效的繁殖技術，且不受外界環境、季節等的影響，能滿足觀賞蕨規?；a的需求[6]。

毛柄雙蓋蕨（Diplazium dilatatum）、狗脊蕨（Woodwardia japonica）、蜈蚣草（Eremochloa ciliaris）、林下 凸軸蕨（Metathelypteris hattori）、刺頭復葉耳蕨（Arachniodes aristata）和扇葉鐵線蕨（Adiantum flabellulatum）均為廣西野生觀賞蕨，其中毛柄雙蓋蕨、狗脊蕨為大型觀賞蕨，蜈蚣草、林下凸軸蕨、刺頭復葉耳蕨為中型觀賞蕨，扇葉鐵線蕨為小型觀賞蕨。除蜈蚣草和扇葉鐵線蕨外，鮮見其余4種觀賞蕨有組培快繁的報道。因此，筆者探討了不同消毒時間對這6 種觀賞蕨孢子萌發和污染率的影響，以期為其無菌培養及規?；a奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 孢子采集

1.1.1 采集地點 毛柄雙蓋蕨、狗脊蕨、刺頭復葉耳蕨的孢子采集于廣西桂林市靈川縣，蜈蚣草、扇葉鐵線蕨、林下凸軸蕨的孢子采集于廣西南寧市西鄉塘區。

1.1.2 采集方法 將具有成熟孢子的完整葉片剪下，放入潔凈、密封的紙袋內帶回實驗室，置于干燥、通風處。6～7 d 后待孢子自然散落時，將孢子收集于小號紙袋中，立即用于接種試驗或用裝有變色硅膠的廣口瓶密封置于4℃冰箱保存。

1.2 孢子消毒

稱取5 mg孢子置于2 mL離心管中 （每種蕨6管），加入適量蒸餾水，充分震蕩后浸泡4 h。用移液槍將蒸餾水吸出后加入0.1% HgCl2分別處理2、4 和6 min（每處理2 管），然后用無菌蒸餾水漂洗4～5 次，最后加入適量無菌蒸餾水配置成孢子懸濁液。

1.3 接種及培養

接種培養基為MS 培養基，pH 值5.8，瓊脂濃度為 6.0 g/L，每瓶接種約1 mL 孢子懸浮液，每處理10瓶，設重復3 次。培養條件為溫度25℃，光照1 200～ 1 600 lx，光照周期12 h/d。

1.4 數據統計及處理

接種2 d 后開始定期觀察，記錄不同處理的孢子污染率、萌發率、第一個孢子萌發的時間、第一株孢子體出現的時間。統計截止到接種后180 d。

污染率（%）=（污染瓶數/接種瓶數）×100

萌發率（%）=（萌發瓶數/未污染瓶數）×100

采用Excel 2010、SPSS 22.0 進行數據統計和分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時長對孢子污染和萌發的影響

如表1 所示，毛柄雙蓋蕨孢子不同消毒時長處理的污染率均低于10%，且隨著消毒時長的增加污染率呈下降趨勢，但3 個處理間無顯著差異；孢子萌發率隨著消毒時長的增加逐漸下降，2 min 處理的萌發率為28.52%，顯著高于4 min 處理（6.67%）和6 min 處理（0%）。蜈蚣草孢子的污染率隨著消毒時長的增加逐漸下降，2 和4 min 處理的孢子污染率分別為31.52%和23.33%，這2 個處理間無顯著差異，但顯著高于6 min 處理的（6.67%）；孢子萌發率隨著消毒時長的增加顯著下降，2 min 處理的萌發率最高（91.67%），顯著高于4 min 處理（9.52%）和6 min 處理（0%）。扇葉鐵線蕨孢子的污染率隨著消毒時長增加呈下降趨勢，4 和6 min 處理的污染率分別為10.00%和6.36%，這2 個處理間無顯著差異，但顯著低于2 min 處理的（22.73%）；孢子萌發率隨著消毒時長的增加呈顯著下降，2 min 處理的萌發率最高（100.00%），顯著高于4 min 處理（37.31%）和6 min 處理（3.33%）。林下凸軸蕨的孢子污染率隨著消毒時長增加呈下降趨勢，但3 個處理間無顯著差異；孢子萌發率隨著消毒時長的增加也呈下降趨勢，2 min處理的萌發率最高（79.96%），顯著高于4 min 處理（38.15%）和6 min 處理的（7.41%）。狗脊蕨孢子的污染率隨著消毒時長的增加呈顯著下降趨勢，6 min處理的污染率最低（10.37%），顯著低于4 min 處理（30.00%）和2 min 處理的（60.74%）；孢子萌發率隨著消毒時長增加也呈下降趨勢，2 min 處理的萌發率最高（66.67%），顯著高于4 min 處理（4.76%）和6 min 處理（8.33%）。刺頭復葉耳蕨的孢子污染率隨著消毒時間增加呈下降趨勢，但3 個處理間無顯著差異；孢子萌發率隨著消毒時長增加也呈下降趨勢，2 和4 min 處理的萌發率分別為24.07%和21.48%，這2 個處理間無顯著差異，但顯著高于6 min 處理的（0%）。

綜合孢子污染率和萌發率分析，毛柄雙蓋蕨、蜈蚣草、扇葉鐵線蕨、林下凸軸蕨、狗脊蕨孢子采用0.1% HgCl2消毒的最佳消毒時長為2 min，刺頭復葉耳蕨采用0.1% HgCl2消毒的最佳消毒時長為2 或4 min。

表1 不同消毒時長處理的孢子污染和萌發情況

2.2 第一孢子萌發和第一株孢子體出現所需培養時間

由表2 可看出，蜈蚣草第一個孢子萌發所需培養時間最短，僅需6 d，隨后依次是扇葉鐵線蕨、林下凸軸蕨、狗脊蕨和毛柄雙蓋蕨，萌發所需培養時間最長的為刺頭復葉耳蕨，需107 d。蜈蚣草第一株孢子體出現所需培養時間最短，為65 d，隨后依次是林下凸軸蕨、狗脊蕨、扇葉鐵線蕨、刺頭復葉耳蕨，所需培養時間最長的為毛柄雙蓋蕨，達178 d。除蜈蚣草孢子體出現所需培養時間低于100 d 外，其余5 種均超過130 d。

3 結論與討論

外植體消毒是建立組織培養無菌體系的首要步驟，因為消毒的效果直接影響后續的培養。蕨類植物孢子消毒方式主要包括：用濾紙將孢子或孢子囊包起消毒、用布將孢子包好消毒和將孢子放入離心管中消毒，常用的消毒藥劑包括0.1% HgCl2、5%次氯酸鈉、70%～75%酒精等，消毒時間一般為2～10 min[7-9]。該試驗采用將孢子放入離心管中消毒的方式，選用0.1% HgCl2作為消毒藥劑，設置2、4 和6 min 3 個消毒時長處理，對6 種蕨類孢子的消毒試驗結果表明，除刺頭復葉耳蕨的最佳消毒時長為2 或4 min 外，其余5種蕨類的最佳消毒時長均為2 min。孢子萌發率最高的為扇葉鐵線蕨，達100%，其他5 種蕨從高到低依次是蜈蚣草（91.67%）、林下凸軸蕨（79.96%）、狗脊蕨（66.67%）、毛柄雙蓋蕨（28.52%）和刺頭復葉耳蕨（24.07%）。

表2 第一個孢子萌發和第一株孢子體出現所需培養時間

孢子萌發一般采用MS 為基本培養基，但有研究表明蔗糖和無機鹽在蕨類孢子萌發前期的主要作用是作滲透壓的調節劑，因而較低濃度的無機鹽和蔗糖濃度有利于孢子從外界吸收水分而開始萌發[4,10-12]。該試驗以MS 為萌發培養基，6 種蕨的孢子均能萌發，但其中狗脊蕨、毛柄雙蓋蕨、刺頭復葉耳蕨的第一個孢子萌發所需培養時間較長，均超過60 d。孢子萌發所需培養時間與蕨的種類相關，但同時也受萌發培養基和預處理的影響。因此后續研究可通過調整培養基的無機鹽和糖分濃度以及采用不同預處理手段如赤霉素處理、溫水浸泡等處理孢子以探討如何縮短孢子萌發所需培養時間。