濟南小清河水樣細菌的分離、分子鑒定及對污染河水的修復作用

岳壽松+邊斐+鄒曉鳳+王翠萍+孫林波+田順+孫凱+陳文娟

摘 要：從濟南小清河水樣中共獲得不同菌落特征的細菌微生物13種，利用分子生物學方法對培養得到的菌株進行分子鑒定及系統發育分析，結果表明：13株微生物分屬于8個屬，分別為腸桿菌屬（Enterobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、克雷伯氏菌屬 （Klebsiella）、微桿菌屬（Microbacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）和寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）。研究了地衣芽孢桿菌QH11和嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌QH13對水體化學需氧量（CODCr）和氨氮（NH3-N）的去除作用，結果表明，處理5天后，QH11對 CODCr和NH3-N的去除率分別為70.6%和84.8%， QH13的去除率分別為58.5%和52.3%。

關鍵詞：小清河；細菌；分子鑒定；生物修復

中圖分類號：S182：X522 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0063-05

小清河發源于濟南市，全長237 km，其中濟南河段位于城區北部，是省城主城區唯一的防洪除澇和排污河道[1]。小清河為典型城市內河，已成為濟南市城市生態系統重要的組成部分。近幾十年來，隨著城市化進程的不斷加快，城市人口聚集，經濟活動日趨頻繁，工業廢水和生活污水大量排放，河水污染逐漸加重，不但制約城市的社會、經濟與環境可持續發展，同時危及人類身體健康。

河道水體是一個復雜的生態系統，微生物為生態系統中的重要組成部分。水體中的微生物種群分布與區域環境有著密切聯系，在物質循環與能量流動中發揮著非常重要的作用[2～4]。河水污染產生的有害氣味以及主要污染指標總氮（TH）和總磷（TP）含量等均與水體微生物的種群特點密切相關[5，6]。微生物對水體凈化具有重要作用，水體污染的微生物修復技術越來越受重視。在污染水體中，微生物經過馴化后大量繁殖，通過其代謝作用將水體中有害的無機物、部分復雜的有機物分解為簡單的、穩定的無毒物質，增強水體的自凈能力[7～10]。與其他治污方法相比，微生物修復技術沒有二次污染、效果穩定、持續時間長，有利于自然生態的恢復。根據不同水體特點篩選功能微生物，對提高污染修復的效率和效益具有重要意義。

本研究對濟南小清河河水細菌進行分離培養，并利用16S rDNA序列分析進行鑒定與系統發育分析，篩選具有降低水體CODCr和氨氮含量的微生物，為濟南小清河水質改善提供理論依據，同時為城市河道污染的原位修復提供基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及細菌分離純化

水樣采集于濟南小清河還鄉店位點。取樣時間2013年6月19日，為雨季到來前的枯水期，河水水質較差。利用LB培養基分別對水樣原液、10-1、10-2和10-3梯度稀釋液平板涂布法培養，培養溫度37℃，培養時間48 h。選取典型菌落，記錄其形態特點，革蘭氏染色觀察菌株形態。純化菌株進行分子鑒定和系統發育樹分析。

1.2 細菌16S rDNA基因的克隆、測序

DNA提取、酶切、連接和轉化等操作方法參照文獻[11]。擴增引物上游P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游P2：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。PCR條件：95℃ 5 min；94℃ 40 s， 55℃ 40 s， 72℃ 2 min，30個循環；72℃ 10 min。PCR擴增產物經膠回收后克隆至pMD18-T載體，轉化E. coli DH5α，將陽性克隆送北京博尚生物公司測序。

1.3 系統發育樹構建

將16S rDNA序列與GenBank已知核酸序列進行BLAST分析。把與該序列同源性較高的已知菌株的16S rDNA基因序列，用ClustalX 1.83進行多序列比對，采用Neighbor-Joining方法，通過MEGA 5.10軟件構建系統發育樹。

1.4 細菌對污染河水的修復作用

1.4.1 試驗菌種 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）均分離自小清河水樣。液體培養繁殖，調節菌液濃度為108 cfu/mL，4℃冰箱儲存備用。

1.4.2 菌株對河水CODCr、氨氮的去除作用 4 L反應器（直徑15 cm）加入3.7 L小清河水樣。按1‰量（V/V）加入各菌劑，對照不加菌劑。每天測定CODCr和氨氮含量。CODCr采用重酪酸鉀法測定，氨氮采用納氏比色法測定。

2 結果與分析

2.1 小清河水樣細菌分離

利用LB培養基對小清河水樣中的細菌進行分離與培養，從各梯度培養基共選取13種典型菌落，記錄菌落形態特點，革蘭氏染色觀察菌株形態（表1）。

2.2 小清河水樣細菌分子鑒定

利用引物P1/P2進行PCR擴增，獲得菌株QH01～QH13的16S rDNA。PCR產物連接到pMD18-T質粒進行測序分析，得到每一菌株的16S rDNA序列全長，將序列提交至GenBank進行BLAST比對，結果見表2。

2.3 系統發育樹構建

進一步利用生物軟件ClustalX 1.83和MEGA 5.10、采用鄰接法（neighbor-joining method）構建16S rDNA系統發育樹，以自展分析 （bootstraping） 法評估發育樹，去除置信度低于50%的分支。結果（圖1）表明，菌株QH02、QH06和QH10親緣關系較近，為氣單胞菌屬（Aeromonas）。其中QH02與嗜水氣單胞菌A. hydrophila CECT-5745最近緣、QH06與豚鼠氣單胞菌A. caviae P087最近緣、QH10 與A. caviae SCSB1最近緣。QH03與克雷伯氏菌聚在一群，且與Klebsiella sp. HE1最近緣。QH01與腸桿菌屬Enterobacter聚為一族，與霍氏腸桿菌E. hormaechei ASU-001 近緣。QH12 與枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter） 聚為一族，與弗氏枸櫞酸桿菌C. freundii MRB070408-1最近緣。QH07與希瓦氏菌屬（Shewanella）聚為一族，與腐敗希瓦氏菌S. putrefaciens Hac334近緣。QH13 與寡養單胞菌（Stenotrophomonas）聚為一族，與嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌S. maltophilia YSP48近緣。QH09和QH11與芽孢桿菌屬（Bacillus）聚為一族，QH09與短小芽孢桿菌B. pumilus N0819 最近緣，QH11與地衣芽孢桿菌B. licheniformis KVR最近緣。QH04和QH05與微桿菌屬（Microbacterium）聚為一族，QH04與微桿菌Microbacterium sp. Long-2最近緣，QH05與磚紅色微桿菌M. testaceum IARI-BHI-3最近緣。QHO8與金黃桿菌屬（Chryseobacterium）聚為一族，與C. taeanense ARB-2 最近緣。系統發育樹分析結果與BLAST比對結果一致。endprint

2.4 不同菌株對污染河水的修復作用

2.4.1 不同菌株對河水CODCr的去除作用 研究了地衣芽孢桿菌QH11、短小芽孢桿菌QH09和嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌QH13對水體CODCr含量的影響。加入菌劑2天后水體CODCr下降趨勢明顯，到第5天時，與對照相比，各處理的水體CODCr去除率分別為地衣芽孢桿菌70.6%、嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌58.5%、短小芽孢桿菌48.5%（圖2）。地衣芽孢桿菌和嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌表現了明顯的水體CODCr清除能力。

2.4.2 不同菌株對河水氨氮（NH3-N）的去除作用 不同菌株處理水體NH3-N含量變化趨勢不同。各菌株對水體NH3-N均有去除作用。與對照相比，去除率分別為地衣芽孢桿菌84.8%、嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌52.3%、短小芽孢桿菌39.4%（圖3）。地衣芽孢桿菌和嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌表現了較強的降低水體氨氮的能力。

濟南小清河水樣中分離鑒定的13株細菌微生物分屬于8個屬，分別為腸桿菌屬（Enterobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、克雷伯氏菌屬 （Klebsiella）、微桿菌屬（Microbacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）和寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas），表明小清河細菌微生物種群的多樣性。這些細菌中既有常見菌，如各類氣單胞菌和微桿菌等，也有條件致病菌如希瓦氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌和嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌，特別是存在對人和動物健康有嚴重威脅的致病菌如克雷伯氏菌、金黃桿菌，因此在修復水環境、凈化水質的同時，要進一步考慮對有害致病菌的防控。

本試驗還研究了從河水中分離鑒定的地衣芽孢桿菌QH11、短小芽孢桿菌QH09和嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌QH13對水污染重要指標CODCr和氨氮含量的去除能力。結果表明，地衣芽孢桿菌對CODCr和NH3-N的去除率分別為70.6%和84.8%，嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌的去除率分別為58.5%和52.3%，短小芽孢桿菌的去除率分別為48.5%和39.4%。地衣芽孢桿菌QH11和嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌QH13均表現出較強的去除污染水體CODCr和NH3-N的能力，對水體污染修復具有開發應用價值。芽孢桿菌是一類重要的益生菌資源，具有降解工業廢水和有機污染物的作用[12～15]，關于芽孢桿菌對城市河水污染修復的報道較少。本研究表明，分離自小清河水中的地衣芽孢桿菌具有很強的去除污染水體CODCr和氨氮去除率的能力，短小芽孢桿菌對水質改良也具有一定作用。嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌屬條件致病菌，近年來發現有些菌株具有特異性降解羽毛等角蛋白質能力[16～18]和對水中重金屬污染的吸附與去除能力[19]。本研究首次發現嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌對水體CODCr和氨氮具有明顯的去除作用。今后將繼續開展地衣芽孢桿菌QH11和嗜麥芽寡養（窄食）單胞菌QH13對水質修復的作用機制研究，為利用微生物技術修復河水污染提供理論和技術基礎。

參 考 文 獻：

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