腦缺血再灌注后大鼠運動皮質SIRT3的表達特點＊

西安市中心醫院神經內科（西安710003）

常明則 吳海琴△ 喬 琳△△ 王新來 狄政莉 劉志勤 毛 佳 田 曄▲

沉默信信調節因子（Silent mating type information regulation 2，Sir2）家族屬于第三類組蛋白去乙酰化酶，通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）參與調節組蛋白乙酰化，在基因沉默、染色質穩定、雙鏈DNA斷裂損傷后生理修復以及延長細胞周期中均起著重要的作用［1］。在哺乳動物共有7個SIRT的同源基因，分別命名為SIRT1-SIRT7。沉默信息調節因子3（Silent information regulator 3，SIRT3）是第一個被定位在哺乳動物細胞線粒體的NAD依賴的去乙酷化酶家族成員，廣泛存在于線粒體基質和細胞核中，目前研究主要集中在調節代謝、防治變性疾病及抗衰老等方面，在線粒體能量生成、代謝、細胞凋亡和細胞內信號轉導等方面發揮重要作用［2～4］。目前，SIRT3在缺血性腦損傷中的作用研究較少，本研究采用免疫組化技術觀察大鼠全腦缺血再灌注后大腦運動皮質內SIRT3的動態變化情況。

材料與方法

1 實驗材料

1．1 試劑與儀器：兔抗大鼠SIRT3單克隆抗體（SantaCruz公司），SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，JGD-RF2射頻雙極電凝器，江灣I型腦立體定位儀。

1．2 動物分組：SD大鼠42只，雌雄不拘，體重200～250g，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供，實驗前將動物置于實驗室適應環境1周，自由進食、飲水，室溫22±2℃，相對濕度65%，每天光照12 h。隨機均分為6組，即：正常對照組，腦缺血再灌注6h、24h、72h、5d和7d組，每組7只。

2 實驗方法

2．1 動物模型的建立：采用改良Pulsinelli四動脈阻斷法［5］，以20%水合氯醛0．6ml／kg腹腔內注射麻醉，5min內痛覺及翻正反射消失，但有角膜反射。將大鼠轉移到腦立體定位儀上，俯臥，頭向下傾斜30度固定，直視下電凝第一頸椎后弓上的橫突孔，阻斷雙側椎動脈；24h后大鼠在乙醚麻醉下仰臥固定，分離兩側頸總動脈，待大鼠清醒后，用微型動脈夾夾閉兩側頸總動脈，腦電圖變為一平線，15min后將兩個動脈夾松開行再灌注。缺血時大鼠沒有昏迷，或發生震顫、翻轉，以及再灌注時發生痙攣、癲癇，均淘汰。

2．2 取材及制片：以20%水合氯醛0．8ml／kg腹腔內注射麻醉大鼠，快速開胸暴露心臟，經左心室插管至升主動脈，用4%多聚甲醛灌注固定1h，開顱取腦，置于相同灌注液12h，脫水后石蠟包埋。參照大鼠立體定位圖譜［6］，用石蠟切片機自前囟后3mm處向后行冠狀位切片，片厚5μm。

2．3 免疫組化及結果判定：腦切片經脫蠟與水化后，至于蒸餾水配置的3%H2O2中，室溫封閉15min，滅活內源性過氧化物酶的活性，并置于0．01mol／L枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH 6．0）中加熱10min進行抗原修復，正常山羊血清做為封閉液。一抗用兔抗大鼠SIRT3單克隆抗體。37 ℃ 復溫 45min，0．01mol／LPBS洗3次，每次2min。后滴加生物素化二抗，37℃恒溫孵育40min。0．01mol／L PBS洗3 次，每次2min并滴加試劑SABC，37℃恒溫孵育20min后以0．01mol／L PBS洗4次，每次5min。再滴加 DAB溶液，室溫下顯色。脫水，透明，封片。光學顯微鏡下觀察大鼠大腦運動皮質，以細胞膜出現鮮艷的棕黃色顆粒為陽性細胞，每張切片高倍鏡（×400倍）下隨機選擇5個不同的視野，計數每個視野中陽性細胞數，取其平均值。

3 統計學處理 本組使用SPSSl3．0軟件進行統計分析，所有檢測數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結 果

光鏡下可見SIRT3免疫反應產物呈棕黃色，胞膜染色為主，主要集中在Ⅱ及Ⅲ層，錐體細胞以及膠質細胞均有表達。正常對照組可見可見散在少量SIRT3蛋白表達；每高倍視野（×400）下正常對照組、再灌注6h、再灌注24h、再灌注72h、再灌注5d及再灌注7d組的SIRT3陽性細胞個數分別為15．14＋2．11、70．71±6．13、86．57±5．03、95．71±6．05、80．71±4．39和53．14±3．80。腦缺血再灌注后各時間點組大鼠大腦運動皮質內SIRT3陽性細胞數較正常對照組增加（P＜0．01）；由6h組、24h組至72h組，大鼠大腦運動皮質內SIRT3陽性細胞數隨再灌注時間延長而增加（P＜0．01）；由72h組、5d組至7d組，大鼠大腦運動皮質內SIRT3的含量隨再灌注時間延長而減少（P＜0．01），詳見附圖。

附圖 各組大鼠運動皮質區SIRT3蛋白表達（SABC×400）A：正常對照組；B：再灌注6h組；C：再灌注24h組；D：再灌注72h組；E：再灌注5d組；F：再灌注7d組

討 論

SIRT3是依賴于NAD＋的去乙酰化酶的Sirtuin家族成員之一，能對線粒體內乙酰化蛋白脫乙酰基恢復或改善其調節蛋白活性，通過增加ROS清除酶活性和穩定線粒體功能來抑制線粒體內ROS的蓄積，增強線粒體氧化作用及呼吸鏈功能，對于緩解和降低氧化應激負荷具有重要意義［7］。Chen等研究證明：SIRT3能夠增強乙酰化的錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性，降低線粒體內ROS水平［8］。近期研究表明：SIRT3能夠提高線粒體中谷胱甘肽還原型／氧化型的比率及乙酰化人叉頭框蛋白O3介導抗氧化損傷，下調ROS水平［9］。

大鼠全腦腦缺血再灌注后，SIRT3表達和活性變化有明顯的動態時間分布特點。本研究通過免疫組化法發現在全腦缺血再灌注后大鼠大腦運動皮質內SIRT3的表達隨再灌注時間延長呈拋物線式變化規律。正常對照組僅可見少量SIRT3蛋白表達，而再灌注后6h組、24h組至72h組，隨再灌注時間延長SIRT3表達增加；由72h組、5d組至7d組，SIRT3表達隨再灌注時間延長而減少。腦缺血后炎癥啟動于急性期，發展于亞急性期，并影響到慢性期的恢復，全腦缺血再灌注后急性期（數小時內），主要由于能量代謝障礙、離子平衡失調、興奮性氨基酸毒性、自由基產生增加等變化，導致神經元急性損傷；亞急性期（數小時至數天），發展為炎癥、細胞凋亡為主的變化［10～11］，72h內的急性期及亞急性期內，SIRT3表達在可能伴隨著炎癥反應啟動、活躍及細胞凋亡等，而慢性期表現為血管新生、神經元及其突觸再生過程中伴隨SIRT3表達的下降，可能與炎癥反應后激發的腦保護機制相關。提示SIRT3可能參與腦缺血再灌注損傷后動態病理生理過程。細胞凋亡存在兩種凋亡途徑：外部途徑和內部途徑，外部途徑又稱之為凋亡受體途徑，其始于死亡配體與細胞表面同族的受體相結合；內部途徑也可稱之為線粒體途徑由許多細胞內和細胞外的刺激引起。于竹芹等研究表明：大鼠腦缺血再灌注后6h海馬區凋亡神經元逐漸增多至再灌注7d凋亡神經元達峰值，隨后至再灌注28d顯著降低［12］，與本研究中腦缺血再灌注后SIRT3時項動態變化的時項規律接近，提示SIRT3可能與腦缺血再灌注后凋亡的發生相關。

因此，我們設想，SIRT3通過調節線粒體ROS水平參與全腦缺血再灌注損傷后凋亡的內部途徑機制，但其在全腦缺血再灌注損傷中扮演的具體的角色等有待進一步研究。

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