大鼠室管膜下區(qū)和齒狀回的EGFR表達(dá)＊

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系·神經(jīng)生物學(xué)研究所 （西安710061）

肖新莉 徐 曦Δ 馮 駿＃ 譚 敬＃ 劉 勇▲

表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）與表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（TGF-α）結(jié)合后，能促進(jìn)體外培養(yǎng)或在體的內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞增殖［1，2］。成年動(dòng)物側(cè)腦室前部的室下區(qū)（SVZ）和海馬的顆粒下區(qū)（SGZ）終生存在著神經(jīng)發(fā)生［3］。根據(jù)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和抗原特征，界定了三類SVZ細(xì)胞類型：膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽(yáng)性（GFAP＋）的神經(jīng)干細(xì)胞（B類細(xì)胞）、表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性（EGFR＋）的轉(zhuǎn)化擴(kuò)增祖細(xì)胞（C類細(xì)胞）和doublecortin陽(yáng)性 （DCX＋）的 神 經(jīng) 母 細(xì) 胞 （A 類 細(xì) 胞）［4，5］。激 活EGFR能極大地刺激SVZ細(xì)胞增殖：小鼠側(cè)腦室注射EGF能促進(jìn)SVZ細(xì)胞增殖［6］，而TGF-α基因敲除小鼠的SVZ細(xì)胞增殖能力下降［7］。神經(jīng)球體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在細(xì)胞自我更新和增殖過程中，EGF是必需的，這進(jìn)一步說(shuō)明了EGF在SVZ細(xì)胞增殖中的核心作用［8，9］。近年發(fā)現(xiàn)：EGFR 信號(hào)通 路參與調(diào) 節(jié)SVZ各細(xì)胞類型間的平衡。Aguirre等［10］報(bào)道EGFR和Nortch信號(hào)途徑在多細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育過程中在調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù)量平衡上有重要作用。在體加強(qiáng)EGFR信號(hào)致使神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，并且神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量和自我更新能力下降，這是通過EGFR介導(dǎo)的Notch信號(hào)調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)觀察大鼠不同發(fā)育時(shí)期SVZ和齒狀回（DG）的EGFR的表達(dá)，旨在明確EGFR在這兩個(gè)區(qū)域表達(dá)的意義及其與動(dòng)物年齡的關(guān)系。

材料與方法

1 BrdU標(biāo)記 生后7d的大鼠處死前一天給予3次BrdU（50mg／kg，腹腔注射，溶解在0．9%生理鹽水和0．007NNaOH，濃度為10mg／ml，Sigma），間隔8h，最后一次注射BrdU后的8h處死，可作免疫熒光雙重染色。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及組織準(zhǔn)備 SD大鼠40只，分為胚胎18d（E18）組，生后1d組（P1）、3d組（P3）、5d組（P5）、7d組（P7）、30d組（P30）、120d組（P120）和365d組（P365），雌雄不限。取孕18dSD大鼠1只，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，頸椎脫臼法處死。取出胎鼠，斷頭取腦，經(jīng)4%多聚甲醛后固定。其他各組大鼠經(jīng)腹腔麻醉，打開胸腔，用0．1MPBS（pH7．4）經(jīng)左心室灌注沖洗，再用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液緩慢灌注固定，切取包含SVZ和DG的腦片，石蠟包埋，切片，片厚7μm，每間隔5片取1片，貼于經(jīng)鉻礬明膠處理過的載玻片上，用于EGFR染色。

3 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟至水，正常山羊血清封閉2h，滴加兔抗大鼠EGFR抗體（1∶100，Santa Cruz），4℃孵育過夜，加山羊抗兔二抗，室溫孵育2h，ABC復(fù)合物室溫孵育1h，每步間用0．01MPBS（pH7．4）洗，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片，陰性對(duì)照片用0．01MPBS（pH7．4）代替EGFR抗體。

對(duì)于BrdU／EGFR雙重免疫熒光染色，腦切片在50%甲酰胺（2×SSC溶液配制，0．3M 氯化鈉，0．03 M檸檬酸鈉）65℃孵育2h，2N鹽酸37℃孵育30min進(jìn)行DNA變性，然后在0．1M 硼酸（pH8．5）室溫孵育10min，加封閉液（5%正常山羊血清）2h后，然后加小鼠抗BrdU（1∶500，Sigma公司）和EGFR（1∶100，Millionpore）在4℃過夜，切片經(jīng)0．01M磷酸鹽緩沖液洗后，加FITC標(biāo)記（1∶100，驢抗兔，Millionpore）和Cy3標(biāo)記（山羊抗小鼠，Millionpore）熒光抗體4h，用熒光封片劑封片后奧林巴斯共聚焦激光掃描顯微鏡觀察結(jié)果。

4 結(jié)果觀察 每只大鼠選取背海馬顳側(cè)的3張切片（連續(xù)切片每12張選1張），使用Image-pro-plus軟件（Olympus，Japan），計(jì)數(shù)EGFR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組將所得數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，采用SPSS10．0軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 側(cè)腦室室管膜和室管膜下區(qū) EGFR陽(yáng)性細(xì)胞呈胞漿和胞膜著色（見圖1～2）。各組室管膜細(xì)胞都呈EGFR陽(yáng)性。側(cè)腦室背外側(cè)角SVZ的EGFR陽(yáng)性細(xì)胞聚集，形成由內(nèi)向外細(xì)胞數(shù)逐漸減少、并且沿胼胝體下方排列的細(xì)胞鏈，在P30，P120和P365側(cè)腦室背外側(cè)角SVZ的EGFR陽(yáng)性細(xì)胞較E18，P1，P3，P7組明顯減少，在P365的側(cè)腦室SVZ背外側(cè)角亦可見較多的EGFR陽(yáng)性細(xì)胞，E18，P1，P5組EGFR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著性地多于其它組（見圖2C）。

2 齒狀回 在齒狀回，顆粒細(xì)胞、一些位于SGZ、分子層和門區(qū)的細(xì)胞呈EGFR陽(yáng)性（見圖3～4）。在分子層，P1時(shí)EGFR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著性地多于P7，P30，P120和P365，并且P3和P5與P120和P365時(shí)的EGFR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比較也有顯著性差異，在顆粒細(xì)胞層，P1，P3和P5的EGFR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著性地少于P7，P30，P120和P365，并且P7與P30，P120和P365的EGFR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較也有顯著性差異（見圖4B-D）。在門區(qū)，出生后7d內(nèi)的EGFR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較多。

3 免疫熒光雙重染色 在SVZ，90%左右的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞都是EGFR陽(yáng)性細(xì)胞。未見室管膜的EGFR陽(yáng)性細(xì)胞呈BrdU陽(yáng)性（見圖5A-C）。在齒狀回，60%～80%在門區(qū)的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞呈EGFR陽(yáng)性細(xì)胞，30%～40%在SGZ的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞呈EGFR陽(yáng)性細(xì)胞，20%左右的顆粒細(xì)胞層的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞呈EGFR陽(yáng)性細(xì)胞（見圖5D-F）。

圖1 EGFR在側(cè)腦室室管膜和室管膜下區(qū)的表達(dá) A：E18；B：P1；C：P3；D：P5；E：P7；F：P30．SVZ：腦室室管膜下區(qū)；LV：側(cè)腦室；標(biāo)尺在圖F：A-E：400μm，F(xiàn)：200μm

圖2 EGFR在側(cè)腦室室管膜和室管膜下區(qū)的表達(dá) A：P120；B：P365．C：各年齡組室管膜下區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；標(biāo)尺＝200μm

圖3 EGFR在齒狀回的表達(dá) A：P1；B：P3；C：P5；D：P7；E：P30；F：P120．ml：分子層；GL：顆粒細(xì)胞層；HI：門區(qū)；標(biāo)尺在圖G：A：800μm，B and C：400μm，D-F：200μm

圖4 EGFR在齒狀回的表達(dá) A：P356．B-D：各年齡組齒狀回各層的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 標(biāo)尺＝200μm

圖5 BrdU與EGFR在生后1周大鼠的室管膜下區(qū)和齒狀回的熒光雙重染色 BrdU：紅色，EGFR：綠色；A-C：室管膜下區(qū)，△雙染細(xì)胞；D-F：齒狀回，△門區(qū)的雙染細(xì)胞，↓：顆粒細(xì)胞層的雙染細(xì)胞；標(biāo)尺＝20μm

討 論

Bouab等［11］研究顯示存在于SVZ和SGZ的神經(jīng)干細(xì)胞隨小鼠年齡增長(zhǎng)再生能力下降。在老年小鼠，大量的成體神經(jīng)干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。實(shí)驗(yàn)揭示中年小鼠（生后1年）和年輕小鼠（生后2月）相比，SVZ的總體產(chǎn)出大幅下降，包括各類神經(jīng)前體亞群細(xì)胞數(shù)目減少，這些變化與SVZ小窩內(nèi)顯著的細(xì)胞學(xué)異常有關(guān)，包括SVZ的萎縮和大量脂滴在室管膜細(xì)胞內(nèi)聚集。中年小鼠SVZ系統(tǒng)產(chǎn)出降低與靜態(tài)相關(guān)變化有關(guān)系。組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明：年輕小鼠和中年小鼠的SVZ的神經(jīng)球形成成體神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目相等，但是中年小鼠的SVZ的神經(jīng)球表現(xiàn)出獨(dú)有的體外培養(yǎng)特性，在體的內(nèi)源性的SVZ區(qū)的成體神經(jīng)干細(xì)胞分裂頻率下降。我們的研究也表明位于SVZ和齒狀回的分子層和門區(qū)呈EGFR陽(yáng)性細(xì)胞隨大鼠年齡增長(zhǎng)數(shù)目下降。

Cesetti等［12］報(bào)道腦片研究發(fā)現(xiàn)，在SVZ，絕大多數(shù)轉(zhuǎn)化擴(kuò)增祖細(xì)胞是EGFR陽(yáng)性細(xì)胞，利用細(xì)胞追蹤技術(shù)顯示這些細(xì)胞在培養(yǎng)的兩天內(nèi)退出細(xì)胞循環(huán)分化為一種介于轉(zhuǎn)化擴(kuò)增祖細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞之間的狀態(tài)。Danilov等［13］超微結(jié)構(gòu)研究顯示神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞的纖毛內(nèi)結(jié)構(gòu)表達(dá)EGFR，并且只有這兩類細(xì)胞能夠結(jié)合BrdU。在細(xì)胞分裂時(shí)，EGFR與紡錘體的微管蛋白關(guān)聯(lián)。我們的研究在SVZ也發(fā)現(xiàn)了大量的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞都是EGFR陽(yáng)性細(xì)胞。室管膜細(xì)胞也表達(dá)EGFR，但是不結(jié)合BrdU，這點(diǎn)與我們的觀察結(jié)果一致。

Okano等［14］使用 H3標(biāo)記胸腺嘧啶，在SVZ和SGZ，發(fā)現(xiàn)大量的含有H3胸腺嘧啶標(biāo)記的細(xì)胞呈EGFR陽(yáng)性。這點(diǎn)與我們的觀察結(jié)果一致。Fox等［15］報(bào)道在齒狀回的一些中間神經(jīng)元表達(dá)EGFR，在我們的研究中，不同年齡階段的大鼠齒狀回的分子層和門區(qū)都能夠檢測(cè)到EGFR陽(yáng)性細(xì)胞，可以推測(cè)這些細(xì)胞絕大多數(shù)都是中間神經(jīng)元。

［1］ Yongjoon S，Kirsten O，Gabi HW，etal．Interaction between DLX2and EGFR regulates proliferation and neurogenesis of SVZ precursors［J］．Mol Cell Neurosci，2009，42（4）：308-314．

［2］ Leker RR，Toth ZE，Shahar T，etal．Transforming growth factorαinduces angiogenesis and neurogenesis following stroke ［J］．Neuroscience，2009，163 （1）：233-243．

［3］ Taupin P，Gage F H．Adult neurogenesis and neural stem cells of the central nervous system in mammals ［J］．J Neurosci Res，2002，69（6）：745–749．

［4］ Doetsch F，García-Verdugo JM，Alvarez-Buylla A．Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain［J］．J Neurosci，1997，17（13）：5046-5061．

［5］ Pastrana E，Cheng LC，Doetsch F．Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny ［J］．Proc Natl Acad Sci，2009，106（15）：6387-6392．

［6］ Craig CG，Tropepe V，Morshead CM，etal．In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain［J］．J Neurosci，1996，16（8）：2649–2658．

［7］ Tropepe V，Craig CG，Morshead CM，etal．Transforming growth factor-alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma［J］．J Neurosci，1997，17（20）：7850–7859．

［8］ Reynolds BA，Weiss S．Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system ［J］．Science，1992，255（5052）：1707–1710．

［9］ Doetsch F，Petreanu L，Caille I，etal．EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells［J］．Neuron，2002，36 （6）：1021–1034．

［10］ Aguirre A，Rubio ME，Gallo V．Notch and EGFR pathway interaction regulates neural stem cell number and self-renewal［J］．Nature，2010，467（7313）：323-327．

［11］ Bouab M，Paliouras GN，Aumont A，etal．Aging of the subventricular zone neural stem cell niche：evidence for quiescence-associated changes between early and mid-adulthood［J］．Neuroscience，2011，173（1）：135-149．

［12］ Cesetti T，Obernier K，Bengtson CP，etal．Analysis of stem cell lineage progression in the neonatal subventricular zone identifies EGFR＋／NG2-cells as transit-amplifying precursors［J］．Stem Cells，2009，27（6）：1443-1454．

［13］ Danilov AI，Gomes-Leal W，Ahlenius H，etal．Ultrastructural and antigenic properties of neural stem cells and their progeny in adult rat subventricular zone ［J］．Glia，2009，57（2）：136-152．

［14］ Okano HJ，Pfaff DW，Gibbs RB．Expression of EGFR，p75NGFR-，and PSTAIR （cdc2）-like immunoreactivity by proliferating cells in the adult rat hippocampal formation and forebrain［J］．Dev Neurosci，1996，18（3）：199-209．

［15］ Fox IJ，Kornblum HI．Developmental profile of ErbB receptors in murine central nervous system：implications for functional interactions［J］．J Neurosci Res，2005，79（5）：584-597．