生物技術在重金屬檢測中的應用

劉 箐， 陳國薇， 張 超， 吳 嫚， 李 森， 吳淑燕， 董慶利

（上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093）

重金屬污染是我國工業化發展面臨的最嚴重的環境問題之一，主要是汞、鎘、鉻、鉛及砷等具有嚴重生物毒性的一系列重金屬元素及其化合物，對環境造成不可逆的長期污染。重金屬最常見的污染途徑，首先是污染大氣、水體及土壤，再經過生物鏈的富集或飲用水進入人體，這些重金屬及其衍生物進入人體后，會引起氧化應激、損傷生物大分子，進而對人體帶來致癌、致畸、致突變等嚴重后果。重金屬污染難以被自然生態自主修復，加上生物鏈對重金屬的富集作用，所以對環境中所有的生物物種的生存、生態環境平衡等，具有長期的惡性影響，是全世界尤其是新興工業化國家必須長期面對的、最嚴重的環境污染問題。

重金屬主要通過口腔、呼吸道和皮膚3種途徑進入人體，進入人體后便不再以離子的形式存在，而是與體內有機成分結合成金屬絡合物或金屬螯合物[1]。重金屬進入人體后，會和蛋白質及酶類發生螯合作用，引起蛋白質內層疏水基團外露，從而使其相互聚集，最終引發蛋白質的聚沉。之前日本爆發的水俁病（汞污染）和骨痛病（鎘污染），就是由于重金屬污染[2]。由此可見，重金屬污染對人體的傷害是非常嚴重的，并且這種傷害是持久的。重金屬污染嚴重影響了人們的正常生活，甚至會對下一代的健康產生危害。因此，重金屬的檢測顯得尤為重要，只有能夠及時準確地檢測出重金屬含量，才能將污染對人類健康的危害降到最低。

對于無法自主修復、無法清除的重金屬污染，進行飲用水、農產品、食品的檢測，成為控制人體攝入重金屬的最后一道屏障。重金屬的檢測自研究起，多采取物理化學方法，如原子吸收光譜（ASS）法[3-5]、電感耦合等離子發射光譜法（ICP-AES）[6-8]、電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）[9-10]、高效液相色譜法[11-12]等，這些方法檢測靈敏、準確度高，有些可以同時檢測多種樣品，但是尚有以下不足：比如必須依賴大型設備、樣品前處理繁瑣、檢測周期較長、對技術人員要求高、檢測成本較高、無法實現現場快速檢測等。近幾年，以生物技術為基礎，結合納米技術、傳感技術、光電技術等交叉學科，對重金屬的快速、簡便檢測提供了可能。這些技術操作簡便，僅需要小型設備，對實驗室及技術人員要求低，檢測成本低，且可以實現高通量檢測。本文中重點介紹酶分析法、免疫分析法、生物傳感器以及生物結合技術等基于生命科學理論和方法的重金屬檢測技術，并對其優缺點及未來發展前景予以綜合敘述評論。

1 酶分析法

酶分析法是根據重金屬離子能夠與一些酶類結合，之后會引起酶類結構的改變，進而導致酶活下降，最終根據產生的一系列可以分析的變化判定重金屬的含量。目前已經有多種酶用于重金屬離子的測定，最常用的是脲酶[13]。

脲酶是一種含鎳的寡聚酶，以尿素酶失活為基礎的安培檢測已經應用于環境樣品中重金屬的檢測篩選。脲酶催化水解的尿素和形成NH4+影響NADH-谷氨酸脫氫酶的偶聯反應體系。重金屬的存在下，樣品中的脲酶活性的抑制，導致產生較低的NH4+和NADH氧化少。2004年Rodriguez B B等[14]利用脲酶這一特性建立了測定重金屬的方法，對Hg2+和 Cu2+的檢測限分別為 0.007 2 μg/mL和0.008 5 μg/mL；對 Cd2+和 Zn2+的檢測限分別為0.000 3 μg/mL 和 0.000 2 μg/mL。 經比較，脲酶靈敏度是較高的，這也是脲酶在酶分析法中應用最為廣泛的原因。2006年Shukor等[15]的研究中利用木瓜蛋白酶作為主體，使用酪蛋白質作為底物，考馬斯染料進行示蹤，進而表征木瓜蛋白酶水解酪蛋白質的程度，進而建立了一種重金屬檢測手段。此方法測定 Hg2+、Ag+、Pb2+、Zn2+的 IC50（具備 50%抑制毒性濃度） 值分別為 0.39、0.40、2.16 μg/mL 和 2.11 μg/mL。對于Cu2+和 Cd2+的Limit of Quantitation （LOQ 檢出限量）分別為4和100 μg/mL。菠蘿蛋白酶是一種巰基蛋白酶，2008年Shukor等[16]利用菠蘿蛋白酶，與木瓜蛋白酶測定方法類似，使用酪蛋白質作為底物，使用考馬斯染料示蹤，測定菠蘿蛋白酶水解酪蛋白質程度，進而建立了一種測定重金屬的方法，最終檢測 Hg2+和 Cu2+的 IC50值分別為 0.15 μg/mL和0.23 μg/mL。此種方法主要就是利用不同酶類對不同的重金屬有著不同的靈敏度建立的一種方法。現在的研究中主要使用一些蛋白酶和脲酶，這些酶使用較普遍并且對金屬離子有著較好的親和力，最終檢測結果也由于不同的酶以及親和力的差異而有較大的差別。2011年Hu等[17]的研究中，使用紫外線處理過的液晶檢測在水相中重金屬的新方法，脲素水解產物可以誘導液晶的取向轉變，通過傳感器研究其光學信息，進而應用于檢測Cu2+，檢測限低于10 μg/mL。

酶分析法在重金屬檢測中得到較好的應用，檢測限也較低，并且操作比較簡單。但是還存在一些不足，首先酶的活性影響因素比較多，所以在檢測過程中容易干擾酶的活性，從而影響最終重金屬測量的結果。并且酶分析法的特異性較低，該方法側重重金屬總含量，而對于其中某種重金屬的含量無法準確測定。目前，可應用的酶類較少，相對于光譜分析法來說，光譜分析法可檢測的重金屬種類更多一些。

2 免疫分析法

免疫分析法（Immunoassay）是一種根據抗原抗體的特異性結合，利用已知的抗原檢測未知抗體或利用已知的抗體檢測未知抗原的方法。由于重金屬離子沒有免疫原性，不能直接產生免疫反應，所以使用免疫分析法分析重金屬離子首先必須選擇合適的化合物與重金屬離子結合，使其產生反應原性，即抗原性，進而將此復合物連接到載體蛋白質上，產生免疫原性。完成這兩步工作后，即可根據抗原抗體的特異性結合進行含量的測定，其中連接重金屬和載體蛋白質的化合物是最重要的因素。

競爭免疫測定一般是在微孔模式下進行，2001年Blake等[18]用一種計算機控制的流式熒光計（KinExA）替代之前使用的微孔模式，抗體在KinExA格式下能以水溶性金屬螯合物進行預平衡，然后這種螯合物能夠迅速通過并且使之固定化。使用這種方法顯現出很好的靈敏度，檢測樣品中的Cd2+，Co2+，U6+和 Pb2+，平均鎘（II）的回收率（114.25+11.37）%，批內和批間精密度變異系數分別為0.81%～7.77%和3.62%～14.16%。2001年Darwish等[19]建立的方法是酶結合物和Cd2+-EDTA之間競爭固定化抗體的結合位點，單克隆抗體用來識別Cd2+-EDTA配合物。通過顏色變化表征EDTA配合物抑制酶結合物的能力，從而確定水樣中Cd2+的質量濃度，其對Cd2+的檢出限為 0.3×10-9g/mL。2012 年 Wang 等[20]選取6-巰基丙酸（MNA）作為雙功能配體，利用其結構上帶有羧基和巰基吡啶環，從而能夠很好地和Hg2+和蛋白質進行結合。然后，使用全抗原免疫小鼠Balb/c小鼠激發免疫學反應，進而制備單克隆抗體。通過脾細胞和Sp2/c細胞融合獲得穩定的雜交瘤細胞株，進行間接競爭性酶聯免疫吸附試驗（ELISA），從而實現對樣品Hg2+的檢測；根據ELISA和Hg2+的關系建立了質量濃度從0.1～100 ng/mL的標準曲線，進而測得IC50和LOD值分別為1.12 ng/mL和0.08 ng/mL。這些方法都是基于抗原抗體特異性結合的特性，選擇合適的化合物再與重金屬離子進行連接，過程相對比較復雜，但是特異性較好。總之，不同的重金屬離子與不同的配體化合物的結合是不同的，所以只有針對不同的重金屬離子進行不同配體的挑選，才能更好地提高檢測靈敏度。

近幾年，免疫膠體金快速檢測應用于很多領域，以其檢測便攜快速為長。膠體金是由氯金酸在還原劑作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，即為膠體金。此方法是利用膠體金作為示蹤物的一種免疫標記技術。2009年及2011年，Kaoru Abe[21-22]等利用膠體金技術成功建立了對水稻、土壤和小麥、茄子中的重金屬鎘的免疫學檢測方法，為實際應用奠定了基礎。2010年Tang[23]等成功制備了Pb2+的膠體金快速檢測卡，檢測限達到50 ng/mL。膠體金免疫檢測技術是一種非常適合現場檢測的技術，并且對于液體的重金屬檢測更加簡便，省去了樣品處理的過程。此方法檢測所需儀器小，能夠更好地實現便攜性，提高檢測效率。但是目前免疫檢測方法還不能取代傳統方法，僅作為輔助檢測方法使用。

3 生物技術與其他技術結合

近年來，生物技術與其他學科交叉產生的技術在重金屬檢測方面得到了較好的發展。生物技術特異性較好，反應靈敏度高，但是由于本身重金屬離子缺乏生物性，并且生物反應結果不能夠很直觀的表征，所以多與傳感器、納米材料及量子點等發展較為前端的科學進行結合。這種交叉能夠更好地突出生物技術的優點，又能通過其他技術彌補生物技術的不足。發展較為全面，研究較為深入的主要是與傳感器及納米材料技術的結合。

3.1 生物傳感器

生物傳感器是一種由固定化的生物敏感材料作為識別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質）與適當的理化換能器（如氧電極、光敏管、場效應管、壓電晶體等）及信號放大裝置構成的一種儀器，最終將其濃度轉化為電信號進行監控。此種方法主要為生物技術與物理學的交叉結合，以生物反應為基礎，進而結合物理信號，通過放大或處理進行檢測。見表1。

表1 生物傳感器在重金屬檢測中的應用Table 1 Application ofbiosensorsin heavy metal detection

生物傳感器檢測重金屬具有便攜性強、高通量、檢測快等優點，為實現在線連續檢測技術的應用提供了可能，并且可以實現多種重金屬的檢測，檢測周期較短。但是，生物傳感器制作過程較為復雜，制作工藝較難，檢測成本高。未來發展生物傳感器檢測重金屬，加強其穩定性和實現多種重金屬離子的檢測是值得多加關注的地方。

3.2 納米技術

與生物技術相結合的納米技術（Nanotechnology）應用于多種檢測技術中，在重金屬檢測上也有了一定程度的應用。主要有結合熒光量子點、金納米顆粒等檢測重金屬離子，具有高靈敏度、高選擇性、成本低、設備簡單等優點。量子點（Quantum Dots），又稱半導體納米晶（Semiconductor Nano crystal），具有熒光強度高、發射峰較窄、抗光漂白性高、發射峰譜可控等優點[28]。納米金即指金的微小顆粒，直徑在1～100 nm之間。納米金具有高電子密度、介電特性和催化作用等特性，并且能在不影響生物活性的前提下與多種大分子生物結合。基于熒光量子點和金納米顆粒的物理優點，與生物技術相結合，在重金屬檢測中得到一定的應用。量子點及金納米顆粒有著較好的生物相容性，可以與寡核苷酸片段、蛋白質相結合，進而通過其物理特性對重金屬離子檢測；也可以連接化學基團，再通過化學基團與蛋白質等進行結合，進而檢測重金屬離子濃度。

2012年Hao等[29]在熒光共振能量轉移（FRET）的基礎上，利用Hg2+和Ag+能夠形成強而穩定的THg2+-T、C-Ag+-C復合物，從而拉近供體Cd Te量子點和受體已標記的寡核苷酸片段，使得能量從供體轉移到受體，轉移過程中產生了熒光能量的改變，因此測得Hg2+和Ag+的含量。此實驗在水介質中檢測Hg2+和Ag+的檢出限分別為 1.8 nmol/L和2.5 nmol/L。增強量子點的熒光可以提高檢測靈敏度；2012年Chen[30]利用金納米粒子，在金納米粒子上連接巰基基團，并且很據此基團的特性再修飾上疊氮化物和炔烴化物，經過這樣處理之后，金納米粒子的分散性得到了提高，并且較之前更加穩定，最終能夠很好地檢測銅離子。他們在還原Cu2+成Cu+的方法上進行了改進，通過電極的還原作用，快速地產生Cu+，大大節省了反應時間，并且視覺檢測限達到了1 nmol/L，提高了檢測的靈敏度。

利用納米技術與生物技術結合檢測重金屬，靈敏度高，特異性強，有望能夠實現現場快速檢測，可以對量子點及納米金進行表面修飾，從而提高其特異性和穩定性，并且為制備微型化的傳感器奠定了基礎。但是量子點制作過程比較復雜，量子點本身污染比較嚴重，多次使用會造成二次污染，且具有一定毒性。納米金顆粒保存時間比較短，易受到離子濃度和pH的影響，這些成為限制其發展的因素。目前該方法主要應用于實驗階段，應用到生產實踐中還需要解決許多問題。

4 存在不足與發展方向

目前針對生物技術方法檢測重金屬還存在幾點不足：

1）食品重金屬檢測的樣品前期處理比較復雜與費時，影響了食品重金屬檢測的發展，進而使得生物檢測手段發展受到限制。

2）重金屬離子本身缺乏生物特性，需要結合其他化合物才能利用生物技術進行檢測。

3）重金屬污染一般為多種重金屬離子導致，使用生物技術檢測一般針對其中某種重金屬離子或者總體，無法較快捷地一次性檢測出其中每種重金屬離子的濃度。

重金屬檢測方法種類多樣，傳統方法有需要繼續傳承的地方，也有需要進一步改進的地方。生物技術的使用，更大程度上提供了現場快速檢測的可能，在現有研究基礎上，克服一些生物技術檢測的不足，勢必會得到更大更好的發展。生物技術在重金屬檢測上的應用也給其他檢測學科提供了新的思路，多方面學科綜合使用，將會實現許多檢測的現場快速應用。

5 結語

生物技術近幾年在各個學科都有較快較好的發展，以其反應快速、靈敏度高為長。在國內經濟快速發展的同時，也衍生出很多污染及食品安全問題。生物技術給許多污染檢測帶來了更加便捷快速的檢驗方法。綜合幾種生物技術方法，基本都是基于生物反應為基礎的，再結合一些物理化學反應原理進行重金屬含量的檢測。生物反應的特異性是應用于重金屬檢測的一大優勢，相對于較為傳統的方法，檢測精度得到了很大的提高。目前許多污染問題檢測周期比較長，并且很難實現現場快速檢測，所以使得重金屬污染治理周期拉長，不能更好地解決環境問題，生物技術為現場快速檢測的實現提供了可能，目前已有較為成功的技術，如膠體金技術等應用于現場快速檢測，大大縮短了檢測周期，并且經濟成本得到了很大程度的降低。通過總結酶分析法、免疫分析法及生物傳感器等幾種生物方法，不難發現生物技術較大程度上提高了檢測的靈敏度，基本上不需要大型儀器，并且生物方法多種多樣，與其他學科結合，可以衍生出多種多樣的方法，加快了實現現場快速檢測的步伐。學科的交叉是創新的源泉，基于生物技術的檢測方法凸顯其特有優勢，與其他學科的交叉將會使其得到更大的發展。

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