女貞子酒抗氧化活性及相關成分浸出率測定*

戴一，宋祖榮，夏蓮鳳，朱建

(安徽新華學院藥學院，安徽 合肥，230088)

女貞子(Fructus ligustri Lucidi)是木犀科女貞屬植物女貞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果實，資源豐富，在中國長江流域及南方各地、河南、陜西、甘肅等地均有分布。女貞子主要含有萜類［1-2］、黃酮［3］及多糖等成分。其中所含黃酮成分主要為芹菜素、木樨草素、芹菜素及其苷等，這些黃酮成分具有保護心血管、抗氧化、抗衰老、降血脂、抗腫瘤等作用［4-5］。女貞子為藥食兩用植物果實，具有滋補肝腎，烏須明目之功效［6］。民間用其泡酒，具體制法為取冬季成熟果實，洗凈，蒸煮曬干后取200 g，放入500 mL低度白酒中，加蓋密封，每天振搖1次，1周后開始服用，每日1～2次，每次1小盅。因補益肝腎，抗衰祛斑多與氧化相關，而植物中黃酮成分常具有較強的抗氧化活性，且文獻未見有關女貞子酒抗氧化活性研究及抗氧化作用的相關黃酮含量的測定，同時也未見白酒酒精度對女貞子抗氧化物質浸出率的研究報道，因此研究白酒酒精度對女貞子酒抗氧化活性的影響及相關黃酮成分含量測定對于科學飲用女貞子酒具有重要參考價值，也為女貞子的綜合利用提供參考。本實驗將10%、20%、30%和40%四種不同酒精度的女貞子酒，濃縮干燥得提取物，采用DPPH法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法研究水提取物對DPPH·、羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用，并測定不同酒精度女貞子酒中抗氧化成分的浸出率，同時采用HPLC測定2種重要黃酮成分木犀草素和芹菜素的浸出率，為女貞子的進一步研究與開發利用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀，安捷倫1260 MWD檢測器，安捷倫1260二元泵，美國安捷倫科技公司;UV-4802S型紫外可見分光光度儀，尤尼柯(上海)儀器有限公司;AB135-S電子分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司;FA2004型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司;移液器，德國Eppendorf股份公司。

1.2 試藥女貞子藥材

女貞子，購自于亳州藥材市場(由本校中藥鑒定教研室慶兆老師鑒定為女貞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果實);DPPH(批號:132805)，(天津西瑪科技有限公司;芹菜素對照品，天津一方科技有限公司;木犀草素對照品，天津一方科技有限公司;甲醇為色譜純，乙醇、三氟乙酸、Al(NO3)3、NaNO2、水楊酸、FeSO4、雙氧水、NaOH、無水乙醇等試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 女貞子酒抗氧化活性實驗

采用DPPH法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法來進行抗氧化實驗，并以樣品的濃度與其對應的自由基清除率采用origin8.0作圖，從中讀取EC50［7-8］。

2.1.1 女貞子酒浸膏的制備

稱取女貞子粉末40 g，用200 mL不同酒精度的白酒進行浸提，每天振搖3 min，浸提1周后抽濾，濾液蒸干后40℃真空干燥48 h，稱重計算得膏率后備用。精密稱取女貞子酒提取物浸膏配制成高中低7個濃度溶液。

2.1.2 DPPH·的清除實驗

精確稱取5 mg DPPH，用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中，配制成0.05 mg/mL的DPPH溶液，于0～4℃避光保存，備用，將樣品原液精確地配制成系列濃度的溶液。分別取樣品溶液5 μL，加水至3.5 mL，加DPPH溶液2.5 mL均勻混合，于黑暗中放置30 min，在517 nm處測定其吸光度值Ai;同時測定3.5 mL水加2.5 mL DPPH溶液的吸光度A0;樣品溶液5 μL，加水至3.5 mL，加2.5 mL甲醇的吸光度 Aj;以2.5 mL甲醇加3.5 mL水做空白對照進行測定。

2.1.3 ·OH的清除實驗

在試管中加入不同濃度的樣品溶液0.1 mL，6 mmol/L水楊酸-乙醇 0.5 mL，6 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL，最后加入0.5 mL 0.1%H2O2，總體積5 mL，以雙蒸水補足體積。其中對照管不加樣液，樣底管不加H2O2，搖勻后啟動反應，37℃ 水浴反應30 min，以蒸餾水作參比，在510 nm下測定各樣品溶液的吸光度。計算·OH的清除率。

A樣品為加入女貞子酒提物溶液后的羥自由基體系的吸光度值;A對照為不加女貞子酒提物溶液的羥自由基體系的吸光度值;A樣底為羥自由基體系中不加H2O2而加女貞子酒提物溶液的吸光度值。

2.1.4 O2-·的清除實驗

取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL于試管中，分別加入1 mL不同濃度的樣品溶液，于25℃水浴中預熱20 min，再加5 mmol/L鄰苯三酚溶液(或10 mmol/L HCl溶液)0.4 mL，搖勻后25℃水浴中準確反應5 min，后迅速加入1 mL 8 mol/L HCl終止反應，在波長420 nm處測吸光度Ai或Aj;同時測定不加樣品溶液的反應體系獲得Ao;測定以4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)、1.4 mL水及1 mL 8 mol/L HCl混合液為空白對照，計算清除率。

2.2 女貞子酒中總黃酮測定

2.2.1 標準曲線繪制

精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.1 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(1 mL含蘆丁0.404 mg)。精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置25 mL 量瓶中，各加水至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1mL，搖勻，放置6 min，加NaOH試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以甲醇溶液為空白對照在500 nm波長處測定吸收度。以質量濃度(C)對吸光度值(A)作回歸統計分析［9］。

2.2.2 供試品溶液制備

精密稱取女貞子粉末5.00 g，4份，分別加10%、20%、30%和40%乙醇定容到25 mL容量品中，每天振搖3 min，浸提7天，微孔濾膜過濾，濾液用于總黃酮測定及HPLC分析。

2.2.3 總黃酮測定

取供試品溶液0.1 mL置25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 1 mL，搖勻，放置 6 min，加濃度為4.0%的NaOH試液10 mL，蒸餾水定容至25 mL，搖勻，放置15 min，在500 nm波長處測定吸收度。根據回歸方程計算女貞子酒中總黃酮浸出率。總黃酮浸出率即女貞子酒中每1 g藥材總黃酮浸出的量(mg)。

2.3 木犀草素、芹菜素HPLC含量測定

2.3.1 HPLC分析條件

色譜柱:Agilent HC-Cl8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 -0.2%三氟乙酸(53∶47，v/v);流速1.0 mL/min，檢測波長350 nm;柱溫25℃;進樣量 20 μL［10］。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取木犀草素和芹菜素各5.00 mg分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，并從中取1 mL定容至10 mL，制成木犀草素和芹菜素濃度均為0.05 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

2.3.3.1 線性關系考察

精密吸取木犀草素和芹菜素混合對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 加甲醇定容至 10 mL，搖勻。精密吸取混合對照品溶液20 μL按2.3.1中的色譜條件進行分析，測定色譜峰峰面積，分別以色譜峰面積(A)對質量濃度(C)繪制標準曲線。

2.3.3.2 精密度實驗

取同一質量濃度的木犀草素和芹菜素混合對照品溶液，重復進樣6次，每次進樣20 μL，計算峰面積的RSD。

2.3.4.3 重現性實驗

精密稱取同一女貞子粉末樣品5.0 g，6份，按2.2.2項下方法操作，制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件測定各樣品的峰面積，計算木犀草素和芹菜素浸出率的RSD值。

2.3.3.4 穩定性實驗

取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12 h 按2.3.1項下色譜條件下進樣分析，計算木犀草素和芹菜素浸出率的RSD。

2.3.3.5 回收率實驗

精密稱取9份已測定木犀草素和芹菜素含量的藥材5.0 g，按所含兩黃酮量的80%、100%和120%比分別加入對照品，每個加樣比做3次實驗，取制成供試品溶液稀釋1倍后進行分析，計算木犀草素、芹菜素的平均回收率。

2.3.4 樣品測定

取女貞子酒供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件下分析，測定峰面積，計算女貞子酒中木犀草素及芹菜素浸出率。浸出率即女貞子酒中每1 g藥材木犀草素或芹菜素浸出的量(μg)。

3 結果與分析

3.1 女貞子酒浸膏得率研究

通過平行3次實驗，研究不同酒精度白酒對女貞子提取率的影響，得不同酒精度下女貞子浸膏得率，結果見表1。可見隨著酒精度的增加，浸膏得率呈逐漸升高趨勢，40%乙醇浸泡得膏率最高，為20.35%。

表1 女貞子酒提取得膏率Table 1 Yield of the total extract from Nvzhenzi wine

3.2 女貞子酒抗氧化活性實驗

3.2.1 DPPH·的清除實驗

通過對7個不同濃度的女貞子酒提取物溶液進行DPPH·的清除實驗，發現隨著酒精度的增加，女貞子酒提取物清除率逐漸升高，尤其在前3個濃度點，清除率隨濃度變化急劇增大，清除率約達到70%后，隨濃度的增加而較為緩慢，其EC50值的大小順序為40%酒精度女貞子酒(EC50為12.75 mg/mL)＜30%酒精度女貞子酒(EC50為14.60 mg/mL)﹤20%酒精度女貞子酒(EC50為14.71 mg/mL)﹤10%酒精度女貞子酒(EC50為15.96 mg/mL)。可見40%酒精度女貞子酒DPPH·的清除活性最強，見圖1。

圖1 不同濃度女貞子酒提取物對DPPH·清除作用Fig.1 Scavenging activity of different concentrations of Nvzhenzi wine extract on DPPH·free radical

3.2.2 ·OH的清除實驗

通過對7個不同濃度的女貞子酒提取溶液進行·OH的清除實驗，發現不同酒精度女貞子酒提取物在50～200 mg/mL范圍內清除率逐步增加，30%酒精提取物的清除率與濃度成較好的線性關系，清除率較高的為40%及30%酒精提取物，其EC50值的大小順序為40%酒精度女貞子酒(EC50為62.86 mg/mL)﹤30%酒精度女貞子酒(EC50為96.81 mg/mL)﹤20%酒精度女貞子酒(EC50為114.04 mg/mL)﹤10%酒精度女貞子酒(EC50為122.41 mg/mL)。可見40%酒精度女貞子酒·OH的清除活性最強，見圖2。

3.2.3 O2-·的清除實驗

通過對7個不同濃度的女貞子酒提取溶液進行O2-·的清除實驗，發現不同酒精度女貞子酒提取物均隨著濃度的增加，清除率也是逐漸升高，尤其在前5個濃度點，清除率隨濃度變化急劇增大，其EC50值的大小順序為40%酒精度女貞子酒(EC50為15.93 mg/mL)﹤20%酒精度女貞子酒(EC50為20.75 mg/mL)﹤30%酒精度女貞子酒(EC50為21.76mg/mL)﹤10%酒精度女貞子酒(EC50為28.04 mg/mL)。可見40%酒精度女貞子酒O2-·的清除活性最強，見圖3。

圖2 不同濃度女貞子酒提取物對·OH清除作用的影響Fig.2 Scavenging activity of different concentrations of Nvzhenzi wine extract on·OH free radical

圖3 不同濃度女貞子酒提取物對O2-·清除作用Fig.3 Scavenging activity of different concentrations of Nvzhenzi wine extract on O2-·free radical

3.3 女貞子酒中總黃酮測定

3.3.1 標準曲線繪制

對6個不同濃度點的蘆丁對照品進行鋁鹽法顯色后500 nm測定吸光度。以質量濃度(C)對吸光度值(A)作回歸統計分析。回歸方程為:Y=13.771X-0.050 4(R2=0.999 4)，表明蘆丁在0.016 2～0.097 0 mg/ml范圍內線性關系良好。

3.2.2 總黃酮測定

對4個梯度酒精度女貞子酒進行總黃酮測定。根據回歸方程計算女貞子酒中總黃酮浸出率結果見表2，可見隨著酒精度的提高，女貞子酒中的總黃酮浸出率亦呈增高趨勢，黃酮成分多具有較多的酚羥基，具有抗氧化活性，與前述抗氧化活性的順序吻合。

3.3 女貞子酒中木犀草素和芹菜素浸出量測定

3.3.1 標準曲線的繪制

對5個不同濃度點的木犀草素和芹菜素混合對照品溶液進樣分析后，以濃度(C)對峰面積(A)繪制標準曲線，得木犀草素和芹菜素回歸方程分別為A=74.919C-29.98，R2=0.999 8;A=80.208C-36.41，R2=0.999 6，二者分別在3.35 ～16.75 μg/mL和2.45～12.25 μg/mL質量濃度范圍呈良好的線性關系。色譜圖見圖4。

表2 女貞子酒中總黃酮浸出率Table 2 The extraction rates of total flavonoids in Nvzhenzi wine

圖4 木犀草素和芹菜素混合對照品HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of standard

3.3.2 精密度實驗、重現性、穩定性實驗

同一質量濃度的木犀草素和芹菜素混合對照品溶液進樣6次分析后，木犀草素和芹菜素峰面積RSD分別為1.03%和1.41%，表明精密度良好，見表3。對6份制備的女貞子酒供試液測定后，木犀草素和芹菜素浸出率的RSD值分別為1.41% 和1.47%，表明具有較好重現性，見表4。對于0、2、4、6、8、10 h 后進樣分析的同一供試液，木犀草素和芹菜素峰面積的RSD分別為0.94%和0.99%，表明供試品溶液在10 h內穩定，見表5。

表3 精密度實驗Table 3 Precision experiments

表4 重復性實驗Table 4 Pepeatability experiments

3.3.3 回收率實驗

9份藥材經加樣制備供試液進行HPLC分析，其結果見表6、表7。木犀草素和芹菜素的回收率分別在97.88% ～98.33%和97.88% ～99.40%之間，RSD值均小于1.5%。

表5 穩定性實驗Table 5 Stability experiments

表6 木犀草素回收率實驗Table 6 Method recevery of luteolin

3.3.4 女貞子酒中木犀草素和芹菜素浸出量測定

對3份女貞子酒提取物進行HPLC分析，供試液色譜圖為圖5，由圖可見隨著女貞子酒精度的降低，木犀草素和芹菜素浸出量明顯下降，當酒精度為10%時2種成分幾乎無峰出現，可見酒精度的高低影響著女貞子酒中黃酮成分含量。

表7 芹菜素回收率實驗Table 7 Method recevery of apigenin

圖5 女貞子酒提取物HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of Nvzhenzi wine extract

具體結果見表7，隨著酒精度的升高女貞子酒中木犀草素和芹菜素的進出量明顯升高，表明女貞子酒中含有較豐富的木犀草素和芹菜素，并可能與其相應的抗氧活性升高有關。

表7 女貞子酒中木犀草素和芹菜素的浸出率Table 7 The extraction rates of luteolin and apigenin in Nvzhenzi wine

4 結論

氧化損傷與多種疾病如衰老、癌癥及心血管疾病等相關［11］，女貞子酒具有較高的保健價值，通過DPPH法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法研究發現女貞子酒提取物對DPPH·、·OH和O2-·有明顯的清除作用，且隨著女貞子酒精度的增高，其提取物對3種自由基的清除作用明顯增強，同時女貞子酒中總黃酮及木犀草素和槲皮素的浸出率也表現出和相同的趨勢即隨著酒精度的升高而升高，說明女貞子酒的抗氧化活性可能與其所含黃酮成分密切相關。40%酒精度女貞子酒提取物表現出最強的自由基清除活性，對DPPH·、·OH和O2-·的EC50值分別為12.75、62.86和15.93 mg/mL，此時女貞子酒中總黃酮、木犀草素和芹菜素的浸出率分別為21.96 mg/g、40.07 μg/g和28.99 μg/g，可見女貞子酒的浸泡，應選擇較高的酒精度，也為其進一步開發提供了依據。

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