Caspase-3、Caspase-12與骨性關節炎軟骨細胞凋亡的關系

馬鋼 崔珈銜 任明姬

Caspase-3、Caspase-12與骨性關節炎軟骨細胞凋亡的關系

馬鋼 崔珈銜 任明姬

目的 檢測Caspase-3, Caspase-12在大鼠骨性關節炎(OA)軟骨中的表達及相互關系, 推斷大鼠OA軟骨細胞凋亡中是否有內質網應激通路的參與。方法 采用Hulth改良法制作大鼠膝關節OA模型, 于造模8周后處死取材觀察大體形態, HE染色觀察軟骨的病理改變, 免疫組織化學染色和Western blot法檢測Caspase-3, Caspase-12在軟骨組織中的表達。結果 大鼠OA模型側軟骨外觀表面粗糙、糜爛、潰瘍；HE染色可見軟骨層變薄, 表層軟骨纖維化變性, 中間層軟骨細胞減少, 深層軟骨細胞肥大, 甚至變成空泡狀；免疫組織化學檢測和Western blot法發現Caspase-3, Caspase-12表達較空白對照側增高, 差異有統計學意義(P＜0.05)。結論 大鼠OA的軟骨細胞Caspase-3, Caspase-12均被激活并調控軟骨細胞凋亡；在軟骨細胞凋亡途徑中, 可能包含ERS介導的通路。

骨性關節炎；軟骨細胞；Caspase-3；Caspase- 12

骨性關節炎(OA)是一種累及膝關節的慢性、退行性疾病,在我國OA患病率高達9.56%。骨性關節炎與軟骨細胞凋亡密切相關［1］, 并且Caspase-3在其中扮演著重要的角色。內質網應激(ERS)是不同于經典細胞凋亡的通路。ERS能影響軟骨細胞的分化, 抑制軟骨細胞的合成功能, 但過度的ERS使細胞表達內質網應激蛋白Caspase-12, 介導軟骨細胞凋亡。內質網應激觸發了一個包括Caspase-12, Caspase-3的特異級聯反應。其中Caspase-12為內質網應激的特異性蛋白, 而Caspase-3為所有凋亡通路的最終執行因子。

1 材料與方法

1.1 材料 健康5月齡Wistar大鼠購自內蒙古大學動物實驗中心, 兔抗Caspase-3抗體、兔抗β-tubulin抗體購自碧云天生物技術研究所, 兔抗Caspase-12抗體購自上海生工生物工程有限公司, HRP標記的山羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術有限公司, DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2 方法

1.2.1 OA動物模型制作和取材：健康級大鼠采用Hulth改良法手術橫斷前交叉韌帶行OA造模, 左側為空白對照側。另選取10只縱行剖開脛骨及股骨, 立即投入100 ml/L中性福爾馬林液, 固定, 脫鈣, 浸蠟, 包埋, 制備蠟塊, 供HE染色及免疫組織化學染色使用。

1.2.2 HE染色觀察關節病變：按常規進行HE染色, 光鏡下觀察軟骨層結構, 細胞的排列及基質染色。

1.2.3 免疫組織化學染色觀察Caspase-3, Caspase-12的表達 采用免疫組織化學SABC法。軟骨細胞中胞質染色成棕黃色顆粒的細胞即為陽性, 并進行平均吸光度(A)值分析, 吸光度值與陽性表達程度成反比。

1.2.4 Western blot法檢測Caspase-3, Caspase-12的表達參照文獻［6］選取每例樣品, 進行分離, 濕式電轉法轉膜,封閉等操作, 用Caspase-3、Caspase-12的A值與β-Tubulin的A值相比表示其表達的相對水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差( x-±s)表示, 采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 關節軟骨大體形態觀察及評分 軟骨標本大體結構觀察顯示。空白對照側膝軟骨光滑呈半透明乳白色, 模型側軟骨表面粗糙、糜爛、潰瘍。

2.2 軟骨組織的組織病理學觀察 光鏡下觀察顯示：空白對照側表層細胞較小, 其長軸平行于軟骨表面呈密集排列,中間層細胞可見“背靠背”雙細胞分布, 深層軟骨細胞肥大呈團分布；模型側軟骨層變薄, 表層軟骨細胞稀疏甚至纖維化變性, 中間層軟骨細胞減少, 深層軟骨細胞肥大, 變成空泡狀。

2.3 免疫組化檢測Caspase-3、Caspase-12的表達

2.3.1 Caspase-3在膝OA軟骨組織中的表達 空白對照側軟骨細胞Caspase-3陽性表達較少, 位于表層, 少見于中間層, 表達的A值(168.30±5.90)；模型側軟骨細胞全層均有Caspase-3較強的陽性表達, A值(99.05±7.65), 與空白對照側比較, 差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3.2 Caspase-12在膝OA軟骨組織的表達 空白對照側軟骨表層偶見Caspase-12陽性表達, 表達的A值(173.75±6.56)；模型側軟骨細胞表層剝脫, 中間層Caspase-12陽性表達增強, A值(115.50±6.31)；與空白對照側比較, 差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 Western blot法檢測Caspase-3、Caspase-12蛋白的表達

空白對照側、模型側軟骨細胞中Caspase-3、Caspase-12蛋白的表達, 模型側表達明顯高于空白對照側, 差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

本研究采用免疫組化及Western blot法檢測各組軟骨細胞中Caspase-3、Caspase-12的陽性表達及變化規律, 結果顯示在大鼠OA模型側關節軟骨組織中, Caspase-3、Caspase-12的陽性表達及蛋白表達均高于空白對照側, 提示在OA的軟骨組織中Caspase-3、Caspase-12均被激活, 并參與調控軟骨細胞凋亡。空白對照側中Caspase-12表達極低, 可能在沒有異常理化因素刺激的情況下, 內質網通路可能存在于正常的細胞衰老及凋亡中。Cheung等研究發現, Caspase-12缺陷小鼠對ERS誘導的細胞凋亡敏感性下降, 但對其他死亡刺激仍然敏感。證明Caspase-12是ERS激活的, 而非死亡受體或線粒體所介導的凋亡傳導信號激活的。這種凋亡信號傳導途徑最終會導致Caspase-3活化, 提示ERS最后被傳到線粒體, 線粒體有可能在這種死亡途徑中起綜合和放大的作用［2］。

綜上所述, 大鼠OA的軟骨細胞Caspase-3, Caspase-12均被激活并調控軟骨細胞凋亡；在軟骨細胞凋亡途徑中, 可能包含ERS介導的通路。

［1］ 周景輝, 吳耀持, 李石勝, 等.鼠類膝骨關節炎模型的評價.中國組織工程研究與臨床康復, 2010, 14(33):6206-6209.

［2］ Tormanen-Napankangas U, Soini Y, Kahios K, et al.Expression of Caspases-3, -6 and -8 and their relation to apoptosis in non-small cell lung carcinoma.Int J Cancer, 2001, 93(2):192-198.

2014-08-04］

010010 內蒙古醫科大學第二附屬醫院關節外科(馬鋼),臨床醫學部(崔珈銜), 基礎醫學院組織學與胚胎學教研室(任明姬)

任明姬