呋甾烷研究進展

李亞麗，逄世峰，鄭培和，曲正義，閆梅霞，張舒娜，王英平

(中國農業科學院特產研究所新藥創制研究室，吉林長春130122)

呋甾烷(Furosine，Furoylmethyllysine，FML)，化學名稱 ε-N-2－呋喃甲基-L-賴氨酸，又名呋甾素、糠氨酸，乳品中常稱糠氨酸［1－2］。FML通常是食品或藥材(藥品)中蛋白質(或氨基酸)與還原糖在高溫炮制或長期儲存時發生Maillard反應產生的系列糖基化終產物(advanced glycosylation end products，AGEs)之一，常作為判斷蜂蜜和牛奶等產品新鮮度或營養損傷程度以及藥材炮制品質的一重要指標［3－4］。亦有大量研究表明，人體內糖基化終產物是老年性疾病的介導因素，可作為測試人體老化進程的時鐘。

蜂王漿中含有豐富的蛋白質、氨基酸及還原糖，因此在一定條件下會發生Maillard反應。Marconi等測定了蜂王漿中FML的含量，并對使用FML作為評價蜂王漿新鮮度的指標進行了可行性研究［5］。在奶粉制造過程中適宜的反應條件可導致FML的生成，加入復原乳的液態奶中FML含量急劇增加，而且FML與乳果糖的比值遠遠大于液態奶［6］。我國農業部2005年發布農業行業標準《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》［7］，其根據FML和乳果糖2種物質在液態乳中的含量，判定巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中是否含復原乳成分。人參等中藥材富含氨基酸、蛋白質和還原糖，儲存和炮制過程常發生Maillard反應，產生多種Maillard產物，如麥芽酚、精氨酸雙糖苷等報道較多，而FML報道較少。另外，研究發現，FML等AGEs的含量在一些人體老化疾病的膠原蛋白和血漿中的含量比正常人高，與人體健康密切相關。

筆者從FML的生化特性與結構、生成機理、測試方法和抑制策略4個方面進行闡述，為完善現行食品或藥品質量標準，進一步規范食品藥品市場和確保人體健康提供一定參考。

1 生化特性與結構

呋甾烷，結構式如圖1所示，化學性質比較穩定。FML已經被證實與多種疾病密切相關，食入過量對人體有害;同時體內糖含量較高時，亦可內源合成。研究表明，FML等AGEs能直接損傷神經組織或和其受體相互作用導致神經病變，參與白內障、動脈硬化、阿耳茨海默氏病、糖尿病、腎炎、網膜癥、神經障礙和心腦血管等人體老化疾病的發生［8－10］，而且食品和藥品有可能是最主要的攝取途徑。近年來研究發現，FML等AGEs的存在還與衰老有著緊密的聯系。在人類和動物的多種組織中隨著年齡的增長不斷積聚，可作為研究衰老的一項重要指標。它隨著年齡的增長，在血清、組織中的生成和積聚是不可避免的。其對酶類有高度的抵抗作用，更新周期長，且具有高交聯性，能改變有關生物大分子的結構和功能，并能與其特異性受體相互作用，通過多種途徑造成組織的交聯損傷，或者誘發突變，造成正常蛋白結構轉變成老年蛋白的結構，隨著年齡增長在體內積聚增多，會造成人體內血管壁硬度增加;或通過直接或間接的作用導致骨代謝的失衡，導致骨質疏松［11］。FML等AGEs存在還會使大腦神經中樞的星形膠質細胞發生一系列形態與功能的變化。

圖1 FML結構式

2 生成機理

由圖2可知，FML是Maillard反應的AGEs之一，在該反應中，氨基酸與還原糖首先縮合生成Shiff堿;該結構不穩定，可自行發生重排而生成Amadori化合物(1-氨基-1-脫氧-2-酮糖)，然后再降解為A-酮醛化合物，它比單糖更易與蛋白質反應，尤其是容易進一步生成棕褐色、具有熒光性的不可逆產物;FML是Amadori化合物在酸性條件下的產物之一，在生物體內的消化酶則不能解離。因此，這種氨基酸被稱為無效氨基酸。FML能夠反映早期Maillard反應的程度，已被作為很多食品或藥品在常溫儲存的貨架期或炮制品質評價指標之一。在糖尿病或其他老齡化疾病人體中，體內葡萄糖(或果糖)與體內多種蛋白質或氨基酸等物質發生非酶促糖基化反應，已經證實這是一個依賴于血糖濃度的化學反應，血糖越高，其合成量就越多。由于還原糖與蛋白質的結合無特異性，它可以與體內各種蛋白質發生糖基化反應，從而在相應的組織或器官中形成AGEs，而且具有不可逆性，既使血糖被糾正，AGEs的水平也不能恢復到正常狀態，而在組織中蓄積［12－13］。

圖2 以葡萄糖和賴氨酸為代表的呋甾烷形成機理

3 測試方法

目前，FML的測定方法有反相離子對色譜法、熒光光譜法、表面熒光法、近紅外光譜法，液－質法和酶聯免疫法(ELISA)等。下面簡單對各種分析方法進行介紹，并對各種方法的優缺點進行分析。

3.1 反相液相色譜法 反相色譜被廣泛應用于FML的分析，大多是針對蜂蜜產品和乳制品等食品中FML的測定。選擇特定的紫外波長或者熒光激發檢測FML。FML是一種強極性的水溶性化合物，大多情況下與蛋白質結合，因此，進行FML測定時一般需要水解，水解液后期常需要過濾和C18柱預萃取、高濃度鹽酸溶液定容等前處理過程，回收率較低。FML是強極性化合物，采用反相色譜法測定時，保留時間太短，干擾也較大。因此在測定時，需要在流動相中添加三氟乙酸或七氟丁酸等離子對試劑，將FML帶回到疏水的反相表面，優化分離條件、增大復雜色譜分析的靈敏度［14－15］。但三氟乙酸或七氟丁酸的強腐蝕性會使色譜柱柱效很快降低，不適用于長期穩定的測定FML，該方法分離度及重復性會隨進樣次數發生變化，而且樣品中的高濃度鹽酸對色譜柱及儀器管路均會造成一定的損壞，國內通用的ODS柱很難耐受，而進口色譜柱成本較高。后來研究者對方法進行了改進，建立了以1-庚烷磺酸鈉為離子對試劑的反相離子對分析方法，消除了三氟乙酸或七氟丁酸對儀器及色譜柱的影響，優化了色譜分離條件［16－17］。反相液相色譜法測定結果重現性好、準確度較高、被測組分出峰時間較快，具有較好的可操作性。但是HPLC缺點在于色譜柱造價高、易損失，且前期處理時間長達24 h。

3.2 熒光光譜法 描述物質的熒光特性有激發波長(Ex)、發射波長(Em)和熒光強度3個參數。FML的最大激發波長是330 nm，發射波長為420 nm［18］。熒光分析法測定有以下3個特定的優勢:①熒光分析法比其他分光光度技術靈敏100～1 000倍;②大多數熒光方法快捷、處理步驟相對簡便;③熒光化合物對環境極其靈敏。

3.3 表面熒光法 熒光分光光度法具有靈敏度高、選擇性強的優點，比常規分光光度法靈敏度高10～100倍。但普通熒光方法有其自身的局限性，當樣品的吸光度＞0.1時，發射光透出會遇到很大阻礙，普通熒光方法就已不再適用。表面熒光方法是一種在普通熒光方法基礎上新發展起來的一種方法，通過將比色杯旋轉56°角，只對比色杯表面一層的待測物質進行檢測，適用于不透明的樣品，省去了很多對樣品前處理的步驟，適用于快速檢測。在激發波長360 nm時，用普通熒光方法在波長410 nm左右得到熒光峰，而用表面熒光方法在波長425 nm處得到熒光峰。其特點是:FML含量低，熒光方法靈敏度高;表面熒光方法不用對樣品進行前處理，快速簡便［19］。

3.4 近紅外光譜法 近紅外光譜(Near Infrared，NIR)是波長范圍在780～2 526 nm的電磁波，近紅外光譜方法利用有機物中含有C－H、N－H、O－H、C－C等化學鍵的泛頻振動或轉動，以漫反射方式獲得在近紅外區的吸收光譜，通過主成分分析、偏最小二乘法、人工神經網等現代化學和計量學方法，建立物質光譜與待測成分含量間的線性或非線性模型，從而實現采用物質近紅外光譜信息對待測成分含量進行計量。近紅外光譜技術可以有效地對乳制品的營養成分含量以及摻假物、殘留物和防腐劑等進行快速、準確、無損地測定，從而檢測牛乳及其乳制品質量［20－21］。

3.5 液－質法 HPLC-MS是有力的定性定量工具，Villamiel等報道了HPLC-MS法測定蜂蜜中FML含量。采用選擇離子檢測方式，用于定量分析檢測離子質荷比m/z為255的［FML+H］+。結果表明，長期儲藏的蜂蜜中FML的含量高于10g/kg，同時蛋白質的含量減少。采用質譜法檢測FML的重現性好，精密度高，檢測定量限(LOQ)低［22］。

3.6 ELISA法 ELISA法檢測FML的方法類似于檢測其他AGEs。采用ELISA試劑盒檢測ELISA水平時，純化的ELISA抗體包被微孔板，并制成固相抗體，微孔中依次加入抗原ELISA和酶標抗體，形成抗體－抗原－酶標抗體復合物。FML最后結合在固相載體上的酶量與其總量有一定的比例，加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中FML抗原的總量直接相關，用酶標儀在特定波長下測定吸光度，FML的總量與吸光度值成正比，然后通過繪制標準曲線計算樣品中FML的總量。在一般情況下，ELISA法檢測FML的優點是快速，價格相對便宜。缺點是容易受到雜質的干擾，精確度值得懷疑。而且，ELISA法中的抗原或抗體主要來自于人體或者動物體內，其用于檢測食源性FML的準確性有待進一步的鑒定。

4 抑制策略

FML等AGEs是導致各種糖尿病慢性并發癥及衰老發生和發展的危險物質，因此減少或消除體內的FML等AGEs則是預防糖尿病并發癥及衰老的一個理想途徑。因此，抑制FML的形成或者阻斷其生成是控制糖尿病慢性并發癥及衰老的關鍵。而FML的來源主要是2個方面:一是內源性還原糖的合成;二是食品及藥品中FML的直接攝入。內源性合成方面最初認為Glu是FML形成的主要前體物，隨著研究的深入，發現其他一些糖類、非糖類活性更高，更利于FML形成，如Fru和甘油醛等，因此應減少低血糖生成指數膳食。

外源性攝入則需要從食品和藥品儲存和加工方面加以控制。首先，FML等AGEs一般認為是Maillard反應的產物之一，所以得從Maillard反應條件控制入手;研究者在探索抑制FML形成的途徑時發現，抗氧化劑能明顯抑制蛋白質的糖基化反應，從而抑制FML的形成［23-24］。同時，大量的研究發現，黃酮類化合物對熒光性AGEs、FML和戊糖素(pentosidine)等有抑制作用，其抑制機理與抗氧化性和清除自由基的作用相聯系，抑制作用主要發生在糖基化反應的前期階段。氨基胍已用做治療糖尿病，其抑制效果是通過抑制還原糖與蛋白質的糖基化反應的進行，達到抑制AGEs生成的目的［25］。

5 結語

目前，蜂蜜及奶粉等產品中FML的測定及抑制已得到研究者的廣泛關注，但是對藥材(藥品)中FML的生成及調控研究的較少，今后應加強藥材(藥品)中FML的生成及調控研究;另一方面，對FML的生成和抑制研究已經取得一定進展，但其抑制機理尚不清楚。今后應加強從動力學的角度研究抑制FML的抑制位點和抑制機理，從而為抑制食品、藥品儲藏和加工過程產生FML提供理論基礎和參考，確保食品藥品質量和人體健康。

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