哈茨木霉在不同條件下菌絲生長和產孢情況研究

文/周洪巖

內蒙古扎蘭屯林業學校 內蒙古興安盟 162650

優化木霉( Trichoderum spp.)被認為是最有希望的生物防治因子。據統計全世界25個國家和美國 43個州的生物防治課題中，大約34%是有關木霉的研究。木霉屬中應用最多的為哈茨木霉( T. harziarum)，常用劑型為麥麩制劑。哈茨木霉一般先通過PDA培養基進行一級培養后，再將孢子洗脫后植入麥麩中進行二級培養，因而其培養周期長、成本高。在一定程度上一級培養技術制約了哈茨木霉的規模生產。近年來，液體培養技術在微生物培養中應用較多，有關哈茨木霉液體培養技術的文獻對木霉液體培養技術作了些探討和實踐，表明哈茨木霉液體培養技術具有培養周期短、孢子產量大、工業化程度高等優點，完全可以在一級培養中代替PDA 固體培養 ，這為哈茨木霉進行大規模工業化生產突破了關鍵的一環；同時也為冬蟲夏草頭孢發酵過程中所排放的廢液找到了生物利用的出路，減少了對環境所產生的污染，并為其他類似微生物培養廢液的生物利用提供了一條綜合開發的思路，具有較強的實用價值。

1 試驗材料和方法

1.1 菌種來源

哈茨木霉菌株是分離自實驗室栽培食用菌灰樹花時染菌的菌袋，由于當時觀察到該菌株生長速度極快，很快覆蓋了被污染的灰樹花菌絲，并迅速長滿菌袋，因此判斷可能成為較好的生物防治菌劑來源，遂對其進行了分離。

1.2 主要試劑

PDB培養液：馬鈴薯（去皮200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL）。

1.3 主要儀器設備

醫用型潔凈工作臺（DL-CJ-1F，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司制造）；

人工氣候箱 （HPG-400H，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司制造）；

智能氣候培養箱（ZPQ-400，哈爾濱東拓科技開發有限公司制造）；

圖1 不同溫度7d的分生孢子產生情況

圖2 不同溫度7d的菌絲干重情況

圖3 不同pH值7d時的產孢情況

圖4 初始pH值對菌絲干重的影響

微量移液器（Finnplpette Theron Electron）；

冰箱(NABILA INDESIT) ；

微波爐（MZ-2270M, 海爾）；

光學顯微鏡（Motic B1SERIES，SYSTEM MICROSCOPES）；

高壓滅菌鍋（SANYO Autoclave MLS-3020，SANYO Electric Co. Ltd.，Made In Japan）；

架盤藥物天平(HC-TP11-5，上海精科)；

攝影顯微鏡（Olympus BX51）。

1.4 試驗方法

將在9cm PDA平板上生長7d的哈茨木霉菌（2號菌株）孢子，用無菌水10mL洗，用血球計數器調制成濃度為107cfu/mL的孢子懸浮液。

PDB培養液的制備：馬鈴薯（去皮200g），用紗布包裹加入盛有1000mL蒸餾水的煮鍋中，煮沸20分鐘后加入20g葡萄糖，攪拌至溶化，每250mL三角瓶中加入100mL PDB培養液。

接菌：將用高壓滅菌鍋滅菌的盛有PDB培養液的三角瓶，移液槍槍頭等物品放入操凈工作臺，用移液槍吸取107個/mL濃度的孢子懸浮液接菌至三角瓶，吸取量根據需求而定。

1.4.1 不同溫度對哈茨木霉生長的影響

每250mL三角瓶中加入100mL PDB培養液，分別在8、16、21、25、30℃恒溫下靜置培養，每處理3瓶，7d鏡檢分生孢子的產生情況，并稱量菌絲干重。

1.4.2 不同pH對哈茨木霉生長的影響

以1mol/L HCl和1mol/L NaOH的溶液分別將三角瓶中的溶液pH調到2、4、6、8、10、12，接種后分別于25℃恒溫條件下靜置培養，每處理3瓶，7d鏡檢分生孢子的產生情況，并稱量菌絲干重。

pH的調制：利用移液槍吸取一定量的HCl或者NaOH加入盛有PDB培養液的三角瓶中，用玻璃棒蘸取少許培養液點加在pH試紙上比對以確定配得所需pH值。

2 試驗結果與分析

2.1 不同溫度對哈茨木霉生長的影響

由表1、圖1和圖2可見，哈茨木霉在溫度為25℃時產生分生孢子量最大，菌絲干重最小。而菌絲干重最大是在8℃，此時分生孢子量最小。

2.2 不同pH對哈茨木霉生長的影響

由表2、圖3和圖4可見，哈茨木霉在pH=6時產生分生孢子量最大，菌絲干重最小。而菌絲干重最大是在pH=12時，此時分生孢子量最小。

目前木霉菌劑的生產多為孢子制劑，為了今后大規模生產木霉菌劑，對哈茨木霉菌的液體發酵條件進行了初步研究。研究發現：哈茨木霉在溫度為25℃時產生分生孢子量最大。而菌絲干重最大是在8℃，此情況下分生孢子量最小。在pH=6時分生孢子量最大，菌絲干重最小。而菌絲干重最大是在pH=12，此情況下分生孢子量最小。

雖然這只是實驗室內的小規模實驗，但對大規模發酵生產具有一定的指導意義。