預處理過程產生的抑制劑對纖維素酶酶解效率的影響

李 鳴 詹 鵬，* 陳介南，* 王亞楠 周永財

（1.中南林業科技大學材料科學與工程學院，湖南長沙，410004；2.國家林業局生物乙醇研究中心，湖南長沙，410004；3.湖南省木本生物質轉化工程技術研究中心，湖南長沙，410004；4.湖南省木質資源定向轉化國際聯合實驗室，湖南長沙，410004）

大力發展可再生能源對于緩解化石能源緊張、改善生態環境等具有重要意義。木質纖維乙醇“不與人爭糧，不與糧爭地”，且可利用農林業剩余物而擴充其原料邊界，是世界可再生能源的重要發展方向之一。楊樹作為我國重要的人工速生林樹種之一[1]，是定向轉化生物乙醇的潛在重要原料，但由于楊木纖維三大組分結合非常緊密，需采用物理法、化學法、生物法等方法進行預處理，釋放纖維素進而進行酶解及乙醇發酵。

選擇合適的預處理方法，不僅可以有效破壞木質纖維各主要成分之間的結合，而且可以降解木質素，提高纖維素的可接觸表面積，使纖維素更容易被纖維素酶酶解為還原糖，便于微生物發酵[2]。在眾多預處理方法中，采用稀磷酸預浸漬+蒸汽爆破的預處理方式可以有效提高還原糖含量和酶解效率，但同時也會促使楊木木質纖維降解生成副產物，如糠醛、5-羥甲基糠醛、對苯二酚、間苯二酚等抑制劑，這些抑制劑將會對后續的酶解及發酵過程產生一定的抑制作用[3]，降低目標產物的得率。

目前對抑制劑的研究大都集中在消除預處理過程中的抑制劑或是抑制劑對葡萄糖發酵產乙醇的影響，對酶解過程的研究幾乎空白。本研究以楊木纖維為原料，研究了稀磷酸浸漬預處理（AT）加蒸汽爆破預處理（SE）技術產生的抑制劑對纖維素酶解糖化過程的影響[4]，探究單一抑制劑、單一種類抑制劑和復配抑制劑對纖維素酶酶解纖維素的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

楊木片，購自湖南常德，經植物粉碎機粉碎得楊木屑（長度0.2～0.8 cm）；磷酸、糠醛、5-羥甲基糠醛（5-HMF）、對苯二酚、間苯二酚均為分析純；微晶纖維素、羧甲基纖維素均為工業純；纖維素酶，滄州夏盛酶生物技術有限公司生產。

QBS-80 蒸汽爆破機，鶴壁正道生物能源有限公司生產；GCMS-20100 Ultra 氣質聯用儀，日本島律公司生產，安捷倫1260 高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司生產；UV-2450 紫外分光光度計，日本島津公司生產；ZhWY-211C 恒溫搖床，上海智城分析儀器公司生產。

1.2 預處理

將自然風干的楊木粉碎成楊木屑，并將其與質量分數2%的稀磷酸按固液比1∶2.5 混勻，浸漬1 h。采用蒸汽爆破機，將預浸漬的楊木屑在爆破壓力2 MPa、保壓時間180 s的條件下進行蒸汽爆破，收集爆破物，測定爆破液中糠醛、5-羥甲基糠醛、對苯二酚、間苯二酚及葡萄糖的含量，取樣測定含水率后，干燥保存備用。

1.3 酶解優化

1.3.1 酶解溫度對還原糖濃度的影響

在酶液載入量30 U/mL、固液比1∶10、pH 值5.0、酶解48 h 條件下，對微晶纖維素、羧甲基纖維素進行酶解，計算酶解溫度分別為35、40、45、50、55、60、65℃時的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶解溫度。

1.3.2 酶液載入量對還原糖濃度的影響

在酶解溫度為50℃、固液比1∶10、pH 值5.0、酶解48 h條件下，對微晶纖維素、羧甲基纖維素進行酶解，計算酶液載入量分別為15、20、25、30、35、40、45 U/mL 時的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶液載入量。

1.3.3 酶解固液比對還原糖濃度的影響

在酶解溫度為50℃、酶液載入量30 U/mL、pH值5.0、酶解48 h 條件下，對微晶纖維素、羧甲基纖維素進行酶解，計算酶解固液比分別為1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13 時的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶解固液比。

1.3.4 酶解pH值對還原糖濃度的影響

在酶解溫度為50℃、酶液載入量30 U/mL、固液比1∶10、酶解48 h 條件下，對微晶纖維素、羧甲基纖維素進行酶解，計算酶解pH 值分別為4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6 時的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶解pH值。

1.3.5 酶解時間對還原糖濃度的影響

在酶解溫度為50℃、酶液載入量30 U/mL、固液比1∶10、pH 值5.0 條件下，對微晶纖維素、羧甲基纖維素進行酶解，計算酶解時間分別為12、24、36、48、60、72、84 h時的酶解液中還原糖濃度，以確定最佳酶解時間。

1.3.6 正交實驗分析

根據單因素實驗結果，選取對酶解效果影響較大的4 個因素：酶解溫度、酶液載入量、酶解固液比、酶解pH 值，設計四因素三水平的正交實驗，進一步優化酶解工藝條件。

1.4 抑制劑對還原糖濃度的影響

根據正交實驗確定最佳酶解條件，在此條件下對微晶纖維素、羧甲基纖維素進行酶解，再分別加入一定種類和質量的抑制劑（糠醛、5-羥甲基糠醛、對苯二酚和間苯二酚中的一種或多種），測定酶解液中葡萄糖及糠醛、5-羥甲基糠醛、對苯二酚、間苯二酚含量，明確抑制劑對還原糖濃度的影響。

1.5 分析方法

采用GC/MS 分析爆破液成分[5]；采用DNS 法測定爆破液還原糖濃度[6]；采用高效液相色譜測定糠醛、5-羥甲基糠醛[7]、對苯二酚、間苯二酚的含量[8]；采用高效液相色譜儀測定纖維素酶解后的還原糖濃度[9]。

2 結果與討論

2.1 預處理

有研究表明[10]，相較于純水+蒸汽爆破（水爆），采用稀磷酸浸漬+蒸汽爆破（酸爆）的預處理方式可以有效疏松木質纖維。圖1所示為兩種預處理方式的對比。從圖1 可以看出，酸爆預處理還原糖濃度為23.61 g/L，比水爆預處理還原糖濃度13.07 g/L 高出10.54 g/L。與水爆預處理相比，酸爆預處理明顯提高了還原糖和抑制劑的含量，這些抑制劑可以通過抑制纖維素酶的酶活，降低纖維素的酶解效果，減少酶解液中還原糖含量，最終影響乙醇的發酵，為后續的酶解發酵過程提供便利。酸爆后各抑制劑濃度分別為：糠醛0.031 g/L、5-羥甲基糠醛0.029 g/L、對苯二酚1.51 g/L、間苯二酚1.242 g/L。

圖1 兩種預處理方式的對比

2.2 酶解優化

2.2.1 單因素條件優化

圖2～圖6所示分別為酶解溫度、酶液載入量、酶解固液比、酶解pH 值、酶解時間對還原糖濃度的影響。

圖2 酶解溫度對纖維素降解率的影響

圖3 酶液載入量對纖維素降解率的影響

從圖2 可見，微晶纖維素的最優酶解溫度為50℃，羧甲基纖維素的最優酶解溫度為55℃；原因可能是纖維素酶主要組成是蛋白質，酶解溫度過高或者過低都會降低纖維素酶的活性，從而使酶解效果下降[11]。從圖3 可見，最優酶液載入量為35 U/mL，原因可能是酶對底物具有競爭性的抑制作用，適當增加纖維素酶用量能夠有效促進纖維素酶與纖維素的結合，從而提高還原糖濃度[12]，但一定量纖維素與酶分子相結合的位點數有限，如果結合點已經被纖維素酶占據，繼續提高酶用量，也不能達到更高的酶解效果[13]；纖維素酶的成本較高，從生產成本考慮，要求盡量減少纖維素酶的載入量[14]，因此，初步確定最佳纖維素酶載入量為35 U/mL。

圖4 酶解固液比對纖維素降解率的影響

圖5 酶解pH值對纖維素降解率的影響

圖6 酶解時間對纖維素降解率的影響

從圖4 可見，酶解液中還原糖濃度隨著酶解固液比的增大而減小，從而使酶解液中還原糖濃度下降[15]；綜合考慮，初步確定最佳酶解體系固液比為1∶10。從圖5 可見，當pH 值=5.0 時，兩種纖維素酶液中還原糖濃度均達到最大，分別為30.32 g/L 和31.79 g/L，原因可能是過高或過低的pH 值都會影響纖維素酶的酶活力[16]，進而影響酶解效果，由此確定pH 值為5.0 時，纖維素酶的活性最大。從圖6 可見，當酶解反應到48 h后，繼續延長酶解反應的時間酶解效率提高緩慢[17]，酶解反應時間越長，生物乙醇的生產周期也就越長，因此在保證能得到較好的酶解效果時，應該盡量縮短酶解反應時間，以此縮短生物乙醇的生產周期[18]。

2.2.2 正交實驗分析

根據單因素實驗結果，選取酶解溫度、酶液載入量、酶解固液比、酶解pH 值4 個因素作為研究對象，酶解時間選取為48 h，設計L9(34)的正交實驗，對楊木纖維酶解的工藝條件進行進一步優化[19]。正交實驗設計表如表1 所示；實驗結果如表2 和表3所示。

表1 正交實驗設計表

從表2 可以看出，影響微晶纖維素酶解的主次順序為：酶解溫度＞酶液載入量＞酶解固液比＞酶解pH 值，最佳酶解條件為：酶解溫度50℃、酶液載入量30 U/mL、酶解固液比1∶11、酶解pH值4.8。

從表3 可以看出，影響羧甲基纖維素酶解的主次順序為：酶解溫度＞酶解固液比＞酶液載入量＞酶解pH 值，最佳酶解條件為：酶解溫度50℃、酶液載入量30 U/mL、酶解固液比1∶11、酶解pH 值4.8。已有研究表明[20]，楊木的最優酶解條件為：酶解溫度50℃、酶液載入量30 U/mL、酶解固液比1∶11、酶解pH 值5.0，這與纖維素的最優酶解條件略有不同。

2.3 抑制劑對還原糖濃度的影響

2.3.1 單一抑制劑對還原糖濃度的影響

圖7 單一抑制劑對纖維素降解率的影響

表2 微晶纖維素正交實驗結果

表3 羧甲基纖維素正交實驗結果

圖7 所示為單一抑制劑對還原糖濃度的影響。由圖7可見，在最優酶解條件下對微晶纖維素和羧甲基纖維素進行酶解時，加入預處理過程中產生的抑制劑，對纖維素降解產生最大影響的是間苯二酚，其次依次為對苯二酚、5-羥甲基糠醛、糠醛，原因可能是酸浸加蒸汽爆破產生的單一酚類抑制劑含量遠高于單一醛類抑制劑，所以單一的酚類抑制劑對酶解的影響高于單一醛類抑制劑[21]。由此可見，在楊木預處理過程產生的抑制劑中，酚類抑制劑對酶解產生的影響要高于醛類抑制劑[22]。

2.3.2 酚類、醛類抑制劑對還原糖濃度的影響

在酸爆預處理的過程中，不止產生單一的抑制劑，因此需要單獨研究酚類抑制劑和醛類抑制劑對纖維素降解的影響。圖8 和圖9 分別為酚類抑制劑和醛類抑制劑對還原糖濃度的影響。

從圖8 和圖9 可見，在最優酶解條件下，添加單一酚類抑制劑和單一醛類抑制劑后，還原糖濃度有明顯降低，且酚類抑制劑對降解率的影響較大，而將兩種酚類抑制劑和兩種醛類抑制劑復配后，纖維素的降解率下降并不明顯，由此可見抑制劑復配后對纖維素酶的酶活產生的影響并不是很大[23]。

圖8 酚類抑制劑對纖維素降解率的影響

圖9 醛類抑制劑對纖維素降解率的影響

圖10 4種抑制劑對纖維素降解率的影響

2.3.3 4種抑制劑對還原糖濃度的影響

圖10所示為4種抑制劑對還原糖濃度的影響。從圖10 可見，在最優酶解條件下，對苯二酚、間苯二酚、糠醛和5-羥甲基糠醛4 種抑制劑復配作用比單一抑制劑或單一種類抑制劑復配對纖維素降解影響更大，并且酚類抑制劑復配的影響作用要高于醛類抑制劑復配，而在4種抑制劑復配后，對纖維素酶解的抑制作用并不是某一單一抑制劑單獨作用的結果，且抑制結果也并非各單一抑制劑結果的簡單疊加，它們之間可能還存在一定的協同作用[24]。

3 結 論

本研究通過對楊木進行稀酸浸漬+蒸汽爆破（酸爆）預處理，探究了爆破過程產生的4種抑制劑對纖維素酶酶解纖維素的影響。

3.1 酸爆預處理的楊木爆破液中，還原糖濃度與抑制劑含量都要高于采用水爆預處理的，其中，酸爆預處理的還原糖質量濃度最高可達23.61 g/L，比水爆預處理還原糖含量13.07 g/L高出10.54 g/L。

3.2 纖維素的最佳酶解條件為：酶解溫度50℃、酶液載入量30 U/mL、酶解固液比1∶11、酶解pH 值4.8；在最優酶解條件與單一種類的抑制劑存在下，對苯二酚、間苯二酚、5-羥甲基糠醛、糠醛對還原糖濃度的影響逐漸降低；多種抑制劑的復配對纖維素降解的影響高于單一種類抑制劑對纖維素降解的影響。