聚己內酯/明膠/富血小板血漿電紡纖維膜的制備及其性能

摘要：采用靜電紡絲技術在聚己內酯/明膠（PCL/GE）支架的基礎上制備了聚己內酯/明膠/富血小板血漿（PCL/GE/PRP）納米纖維支架，考察了該材料的密度、孔隙率、親水性、降解速率以及其細胞相容性。結果表明，PCL/GE/PRP 纖維膜的密度及孔隙率介于PCL和PCL/GE纖維膜之間，直徑集中在100~400 nm，相比于PCL/GE纖維膜，PCL/GE/PRP纖維支架的親水性更好，早期降解速度更快，且更利于大鼠脂肪源干細胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）的生長、增殖。

關鍵詞：靜電紡絲；納米纖維支架；細胞相容性

中圖分類號：TB332文獻標識碼：A

靜電紡絲是近年來興起的一種可制備直徑在納米至微米級的超細纖維材料技術。該法制備的納米纖維具有與細胞外基質（ECM）相似的結構特點和生物學功能[1]，可作為細胞生長的多孔支架，促進細胞的遷移和增殖。靜電紡絲技術原料來源廣泛，其中生物相容性和力學性能較好、可降解、易加工且成本低廉的合成高分子材料聚己內酯（PCL）已得到廣泛運用[2]。然而由于PCL表面缺乏細胞親和位點、親水性能差、降解速度較慢，不利于細胞在組織支架的粘附[3]，故該材料在運用中仍需改進。天然材料明膠（Gelatin，GE）亦被廣泛運用于組織工程材料領域，它具有較好的親水性，有特異性細胞黏附位點，但其力學性能差[4]。若將GE與PCL制成復合材料不僅能增強細胞黏附，改善PCL的親水性能和調節其降解速度，還令其具有良好的機械強度。

種子細胞、支架材料、生物活性因子是組織工程的三要素之一，其中生物活性因子可以提供恰當的細胞刺激信號，從而誘導細胞的增殖和分化。近年來有關富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）的運用日益增多[5-6]。PRP是利用自身血液制作的含高濃度血小板的血漿，其血小板在激活后可大量分泌具有促進傷口、組織愈合和細胞再生的多種生長因子，因而PRP亦稱為\"富含生長因子血漿\"[6-8]。本研究在PCL紡絲過程中混紡一定濃度的GE，并在此基礎上制備了含PRP的PCL/GE納米復合纖維材料支架，以大鼠脂肪源干細胞（ADSCs）作為實驗細胞，考察了復合纖維膜的結構、降解速率及其生物相容性，為制備理想的組織工程支架材料提供新思路。

1實驗部分

1.1實驗試劑及設備 聚己內酯（PCL）：美國Sigma公司；明膠（GE)：北京索萊寶科技有限公司；α-MEM培養基：美國Invitrogen公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；胰酶：美國Gibco公司；大鼠脂肪干細胞：南昌大學一附院泌外研究所提供。

掃描電鏡（SEM）：TESCAN公司VEGA3型；傅立葉紅外光譜儀：美國BRUKERTENSOR-27；接觸角儀：德國KROSSDSA100。

1.2電紡纖維膜的制備

1.2.1 PCL電紡纖維膜 常溫下稱取0.9 g PCL溶于10 mL的TFE溶劑中，制備9wt% 的PCL電紡液。使用7號的針頭進行電紡，電紡電壓為22 kV，接收距離15 cm，注射泵推進速率為3.0 mL/h，溫度為37℃。關閉高壓，停止注射泵，收集到PCL纖維膜，真空冷凍干燥24 h。

1.2.2 PCL/GE電紡纖維膜 常溫下稱取0.36 g PCL和 0.54 g GE分別溶于4 mL的TFE中，混合后加入10 μL乙酸（HAc），再補充2 mL TFE，得到9wt% 的PCL/GE電紡液。電紡方法與前述相同，電紡溫度為50℃。

1.2.3 PCL/GE/PRP電紡纖維膜 預先同上制備PCL/GE電紡纖維膜，隨后將PRP直接電噴在上述已紡織成功的PCL/GE纖維膜上，然后再電紡一層PCL/GE纖維膜，形成三明治結構的復合納米纖維膜，真空冷凍干燥備用。

1.3表征測試

1.3.1纖維膜密度及孔隙率測試 采用稱重法測量纖維膜密度，具體過程如下：將20 mL密度瓶充滿去離子水，稱量其質量m1，將質量為m2的電紡纖維膜放入充滿水的密度瓶中，稱量其質量m3（n=4）。利用下列公式求得纖維膜密度ρ，單位為g/cm3：ρ=m2/（m1+m2-m3），得到纖維膜密度ρ后，再利用下列公式求得纖維膜孔隙率ε：ε= (1-ρ/ρ0）×100%公式中ρ0為電紡液自然凝固后的模塊密度，單位為g/cm3。

1.3.2 SEM形貌 將待測樣品噴金后在掃描電鏡下觀察其微觀形貌，得到的SEM照片使用Adobe Photoshop軟件對其中的纖維（n=100）進行直徑測量。量取照片上所有不同位置的纖維計算每根纖維的平均直徑，然后計算纖維膜中超細纖維的平均直徑和直徑分布。

1.3.3 全反射傅里葉紅外光譜分析（ATR-FTIR） 采用傅立葉紅外光譜分析儀對各電紡纖維膜表面的化學官能團進行分析。

1.3.4 靜態接觸角及吸水性測定 采用靜態接觸角測試機上測試各纖維膜表面的親水性。所有測試均在室溫下進行，所用水滴體積0.25 μL。

取纖維膜樣品（2 cm×2 cm，n=3），用分析天平稱得初始質量m0；在PBS緩沖溶液中浸泡24 h后取出，用濾紙吸去膜表面和邊緣的水分，稱重得m1。取每種纖維膜三組數據取平均值，作為其吸水率數據。吸水率＝(m1-m0)/m0×100%。

1.3.5體外降解性測試 干燥稱重（W0），分別浸入模擬體液（0.01M PBS，pH=7.4）并置于37℃恒溫水箱中（n=3）。隔周換液，分別于1月、2月、3月時取出，37℃恒溫干燥48 h至恒重（Wn），失重率（W%）公式如下。W%=（W0-Wn）/W0×100%，式中，W0式樣的初始重量，Wn式樣n月后的重量，單位為g。

1.4生物學特性研究

1.4.1大鼠ADSCs的培養 常規培養大鼠ADSCs，選擇處于對數生長期的ADSCs 用于實驗，將細胞濃度調整為為4×105/mL的單細胞懸液。

1.4.2體外細胞相容性檢測 將輻照消毒后的各纖維膜（面積0.8 cm×0.8 cm）分別置于24孔板中，每組3個復孔，培養基浸泡后，接種大鼠ADSCs單細胞懸液于24孔板內，置5% CO2、37℃的飽和濕度培養箱中培養，隔日半量換液。分別于接種1、3、5、7 d后固定細胞，DAPI染色、倒置熒光顯微鏡下計數纖維膜上細胞。

1.5統計學方法 結果以均值±標準差（x±s）表示，采用SPSS18.0統計學軟件、單因素方差分析（one-way ANOVA）進行統計學運算。P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有顯著統計學意義。

2結果與討論

2.1表征測試

2.1.1纖維膜密度及孔隙率測試 PCL、PCL/GE和PCL/GE/PRP纖維膜密度分別為：（0.122±0.003）g/cm3、（0.844±0.085）g/cm3、（0.371±0.012）g/cm3，孔隙率分別為：（0.874±0.003）%、（0.158±0.085）%、（0.681±0.009）%。兩指標組間兩兩比較差異均有統計學意義，見圖2，P＜0.01。可見GE的引入不僅可以提高纖維膜密度，且能改變原有支架的孔隙率。在PCL/GE纖維膜的基礎上引入PRP后，纖維膜的密度及孔隙率較PCL和PCL/GE纖維膜有不同程度改變，位于二者之間。

2.1.2 SEM形貌 PCL、PCL/GE、PCL/GE/PRP纖維膜的掃描電鏡圖，見圖1。所示，直徑分別為（323±138）nm、（282±109）nm、（288±149）nm。圖像分析結果表明，膜纖維直徑分布范圍主要集中在100~400 nm，屬納米級纖維，該三維立體孔隙構架可為細胞生長爬行提供有效空間。

圖1 各纖維膜掃描電鏡圖

2.1.3 ATR-FTIR圖譜形貌 a譜中1700~1760 cm-1處存在一個強吸收峰，此峰為C=O伸縮振動峰，是PCL的特征吸收峰；b譜中，1700~1760 cm-1處是PCL的特征峰，GE分子有大量的氨基存在，在1640~1650 cm-1和1500~1560 cm-1 處有強的吸收峰，此為GE中的氮氫鍵（N-H）變形振動吸收峰。PCL和GE的特征峰出現，表明采用三氟乙醇為溶劑，可以較好混紡PCL/GE纖維；由于ATR-FTIR只能表征出材料表面的化學官能團，鑒于PRP中的各種生長因子含有大量的氨基，而PCL/GE和PCL/GE/PRP支架在1640~1650 cm-1和1500~1560 cm-1處峰（即N-H變形振動峰）面積相當(b和c譜)，可見PRP的引入并未影響到材料表面化學基團的檢測，說明本研究采用電噴法將PRP夾在PCL/GE薄膜中間的方法可以將生物活性因子成功包被，見圖2。

圖2 各纖維膜ATR-FTIR圖譜

注：a：PCL纖維膜 b：PCL/GE纖維膜 c：PCL/GE/PRP纖維膜。

2.1.4靜態接觸角及吸水率檢測 水滴接觸角的測定用于評估材料的親水性，接觸角越小，表明材料表面親水性越強。在室溫下，水滴PCL纖維膜上的接觸角為109°，混紡后，PCL/GE纖維膜、PCL/GE/PRP纖維膜接觸角減小至0°。可見PCL的親水性差。由于GE分子鏈上帶有大量的氨基以及羧基等親水性基團，故GE混紡在PCL纖維膜后可使纖維的親水性能顯著增加，見圖3A。

PCL、PCL/GE和PCL/GE/PRP纖維膜在相同環境中吸水率分別為（0.219±0.013）、（3.331±0.050）、（3.082±0.094），見圖3B，各纖維膜親水率兩兩比較均存在統計學差異（*P＜0.05，**P＜0.01）。吸水性實驗結果進一步表明GE的引入顯著提高了PCL膜的親水性。采用夾心法將PRP引入PCL/GE纖維膜內部后制得的PCL/GE/PRP支架的吸水率明顯高于PCL/GE纖維膜，表明引入PRP更有利于提高材料親水性。

圖3 各纖維膜的接觸角及吸水率分析（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.1.5體外降解性測試 各纖維膜在不同時間點的體外失重率變化。從表中可以看出在各個時間點PCL/GE/PRP纖維膜與PCL/GE纖維膜的失重率均明顯大于PCL纖維膜（*P＜0.05，**P＜0.01），說明GE的引入可以促進復合膜中PCL膜的降解。第30 d，PCL/GE/PRP纖維膜的失重率顯著高于PCL/GE纖維膜（#P＜0.05），而隨著時間的延長，二者的失重率趨于接近，表明PRP可在早期加速PCL膜的降解，見表1。

2.2體外細胞相容性檢測 PCL/GE/PRP組與PCL/GE組細胞數目在各個時間點均顯著高于PCL組，說明GE的引入有利于細胞的增殖，見圖4。第1 d PCL/GE/PRP組與PCL/GE組的細胞數目大致相等，從第3 d開始，PCL/GE/PRP組的細胞數目明顯高于PCL/GE組，差別有統計學意義（*P＜0.05，**P＜0.01，##P＜0.01），表明PRP在早期階段即可促進大鼠ADSCs的增殖。

圖4 各纖維膜上大鼠ADSCs生長情況（×50 μm）

3結論

本實驗表明，PCL/GE/PRP納米纖維膜的密度、孔隙率、外觀及直徑與PCL和PCL/GE纖維膜有一定差異，其各項參數均符合生物工程支架的基本性能要求。就親水性能、降解時間及細胞相容性而言，PCL/GE/PRP和PCL/GE纖維膜更適用于組織工程皮膚支架，且PCL/GE/PRP纖維支架的親水性更好，早期降解速度更快，且更利于細胞的生長。

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編輯/張燕