一種新型解脲脲原體核酸檢測試劑盒的臨床應用初步評價

摘要：目的通過對比實驗，對新型解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，UU）核酸檢測試劑（采用一步法處理樣本，以下簡稱\"一步法\"）的臨床使用進行評價。方法用一步法試劑與煮沸法試劑對176例臨床收集的樣本進行UU DNA檢測并對比其結果，同時，將兩種試劑的檢測結果分別與培養法結果進行對比。結果新型解脲脲原體核酸檢測試劑與煮沸法試劑的陽性一致性百分比為99.00%，陰性一致性百分比為96.05%，總一致性百分比為97.73%；對4例不符樣本進行測序復核，并對復核后的結果進行Kappa檢驗一致性分析，結果Kappa值=1.000，表明新型試劑的檢測結果與煮沸法試劑及復核檢測的結果具有很好的一致性。在與金標準培養法檢測結果的對比中，兩種試劑均表現出較好的準確性。結論新型解脲脲原體核酸檢測試劑與已上市煮沸法試劑的檢測結果陰陽性一致性較好，操作簡單快速，減少污染環節，并具有內標控制假陰性，靈敏度更高，結果準確，符合臨床檢測要求，具有較高的臨床應用價值。

關鍵詞：解脲脲原體；UU DNA；熒光定量PCR；一步法；煮沸法解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，UU）是一類原核細胞微生物，體積介于細菌與病毒之間，是引起泌尿生殖道感染的常見病原體[1]。UU感染不僅引起非淋菌性尿道炎（nongonococcal urethritis，NGU），也可引起多種泌尿生殖道疾病，如前列腺炎、附睪炎等，還被認為是引起女性原因不明的不孕、流產以及死胎等的原因之一。由于UU感染臨床表現無特異性，常易漏診，因此，快速、靈敏、特異的診斷方法是預防UU感染的關鍵[2]。目前解脲脲原體的實驗室診斷方法主要有分離培養法、免疫學方法、基于核酸檢測的分子生物方法等。分離培養法的特異性和敏感性高，但其具有臨床檢測時間過長（至少需要24~48 h，甚至更長時間），過程繁瑣，需要使用特殊的培養介質以及易受雜菌影響等缺陷，不適用于大范圍檢測。免疫學法具有快速、簡便、靈敏度高等優勢，但受多種因素的影響，目前國內也沒有商品化的試劑盒（僅有一個蛋白芯片檢測系統獲得批準認證）。近年來，聚合酶鏈式反應(PCR)法漸漸顯現了其在檢測上的優勢，熒光PCR技術是基于傳統PCR技術并結合光譜技術而發展起來的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測技術。檢測結果準確，重復性高，能動態反映患者治療前、后病原體變化及與臨床的關系，且整個過程中避免了傳統PCR需后處理的問題，減少了污染[3]。但目前國內同類試劑一般采用煮沸法提取核酸，費時費力，在操作過程中容易導致污染，而且大部分試劑沒有預防假陰性的內標控制和抗污染系統，影響檢測結果的重復性和穩定性。最近，新出現了一種一步法UU 核酸檢測試劑，它完全免去了核酸提取過程。根據其說明，UU核酸經常溫裂解后全部釋放參與到PCR反應中，整個過程無污染、操作極其簡單、迅速。本研究擬通過檢測臨床樣本，將其與市場上的煮沸試劑進行比對，來評估這一新方法的準確性及特異性。

1資料與方法

1.1一般資料 本次研究共檢測生殖道分泌物樣本176例，其中男性病例87例（49.4%），女性病例89（50.6%），-20℃冰箱保存。

1.2主要試劑和儀器 新型UU核酸檢測試劑購自湖南圣湘生物科技有限公司，采用一步法技術處理樣本（以下簡稱\"新型試劑\"或\"一步法試劑\"），具有內標監控假陰性，最低檢測限為400 copies/mL；同時，選擇一種臨床使用客戶較多的國產UU核酸檢測試劑，采用煮沸法提取樣本核酸，沒有內標監控，作為對照試劑，最低檢測限為500 copies/mL。核酸擴增儀采用美國Stratagene公司的Mx3000P實時熒光定量PCR儀。

1.3方法 分別采用兩種熒光定量PCR檢測試劑對176例臨床樣本（每例樣本一分為三，保留一份樣本作為復檢）進行檢測，方法如下。

1.3.1煮沸法 取200 μL臨床樣本，12000 rpm離心5 min，去上清；向沉淀中加滅菌生理鹽水500 μL混勻，12000 rpm離心5 min，去上清；向沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min，12000 rpm離心5 min備用；取2 μL作為PCR反應的模板，加入分裝有PCR反應液的反應管中上機檢測。

1.3.2一步法 PCR反應管中加入5 μL\"核酸釋放劑\"，加入5 μL標準品、待檢樣本，吸打混勻，加入40 μL PCR反應液，吸打混勻上機檢測即可。

1.4統計學分析 數據進行陰陽性一致性分析，靈敏度、特異度分析和kappa檢驗一致性分析。

2結果

2.1擴增曲線對比，見圖1~3。

2.2根據煮沸法試劑檢測結果將臨床樣本分為陽性組和陰性組，見表1。

2.3新型一步法試劑與煮沸法試劑檢測結果的一致性性分析：

陽性一致性百分比=A/(A+C)×100%=99 /（99+1）×100%＝99.00%；

陰性一致性百分比= D/(B+D)×100%=73 /（3+73）×100%＝96.05%；

總一致性百分比=(A+D)/(A+B+C+D) =（99+73）/176×100%＝97.73%

2.4新型一步法試劑與金標準培養法檢測結果的統計分析，見表2。

靈敏度Se=TP/(TP+FN)×100%=97/(97+1)×100%=98.98%

特異度Sp=TN/(FP+TN)×100%=73/(5+73)×100%=93.59%

靈敏度Se+特異度Sp=98.98%+93.59%=192.57%>100%

2.5煮沸法試劑與金標準培養法檢測結果的統計分析，見表3。

靈敏度Se=TP/(TP+FN)×100%=97(97+1)×100%=98.98%

特異度Sp=TN/(FP+TN)×100%=75/(3+75)×100%=96.15%

靈敏度Se+特異度Sp=98.98%+96.15%=195.13%>100%

2.6不符樣本的復核結果及其分析 根據結果，有4例樣本新型一步法試劑與煮沸法試劑檢測結果不符：其中3例煮沸法試劑檢測為陰性（檢測濃度處于400~1000 copies/mL且樣本性狀相對復雜），而新型一步法試劑檢測為陽性（檢測濃度>400 copies/mL）；另1例煮沸法試劑檢測為陽性，而新型一步法試劑檢測為陰性。在兩個試劑盒的靶基因擴增區域外圍序列，設計引物對，對這4例樣本進行PCR擴增，克隆測序復核，結果：3例新型試劑檢測為陽性的樣本測序結果均包含UU-DNA序列，可能其靈敏度較之煮沸法試劑更高或抗干擾能力更強；而煮沸法試劑檢測為陽性的1例樣本無PCR擴增片段，懷疑為交叉污染所致。測序復核后的統計結果，見表4。

應用Kappa評價方法對新型試劑和對照及復核檢測結果進行診斷一致性分析，檢驗水準為α=0.05。對Kappa值的參考評價原則如下：0.75＜κ≤1時，診斷一致性好；0.4＜κ≤0.75時，診斷一致性一般；0≤κ≤0.4時，診斷一致性差。經SPSS15.0軟件Kappa檢驗的輸出結果，見表5。

由以上輸出結果可知，Kappa值=1.000，P=0.000。α=0.05檢驗水準下，新型一步法試劑與煮沸法試劑及復核檢測結果的一致性有統計學意義，診斷一致性好。

3討論

目前國內臨床上主要采用煮沸法對解脲脲原體的核酸進行提取，具體是先將分泌物樣本濃縮、洗滌、再加裂解液、煮沸、高速離心、取上清為模板；該方法核酸提取過程較復雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，經過煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個步驟，樣本中的DNA存在損耗，同時由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污。

本研究對一種新型的免核酸提取的解脲脲原體熒光定量PCR檢測方法(一步法)與常規的煮沸法進行對比研究。整個臨床試驗過程均在嚴格控制下進行，由經專門培訓的測試人員進行檢測分析。用一步法檢測，每個病例只需取少量生理鹽水洗脫樣本，處理簡單，無需加熱、轉移上清等操作，可大大減少污染的發生，擴增和熒光檢測均由儀器自動進行，通過查看樣本的Ct值判斷陰陽性。

本次研究共檢測樣本176例，根據煮沸法試劑檢測結果分為兩組：其中陽性組100例，陰性組76例。新型解脲脲原體核酸檢測試劑與煮沸法試劑的陽性一致性百分比為99.00%，陰性一致性百分比為96.05%，總一致性百分比為97.73%；對4例不符樣本的復核結果表明：4例樣本的測序結果均與新型試劑相符。對復核后的結果進行Kappa檢驗一致性分析：結果Kappa值=1.000，表明新型試劑與煮沸法試劑及復核檢測的結果具有很好的一致性。在與金標準培養法檢測結果的對比中，兩種試劑均表現出較好的準確性。

研究中發現：一步法的樣本處理和檢驗過程在一個PCR反應管中即可完成，樣本中的核酸在核酸釋放劑的作用下全部釋放并參與到PCR反應過程中，同時無需離心、振蕩、更換離心管等一系列繁瑣操作，既簡化了操作步驟，又節省了耗材成本，而且無需加熱、開/關管蓋、移液等可能導致核酸丟失與污染的操作，抗污染能力強，實驗結果的重復性大大提高，對操作人員的技術要求較低。一步法節省檢驗時間，減少污染環節，有內標監控假陰性，結果準確，保證臨床醫生及患者及早得到診斷結果，避免等待試驗結果的焦慮，具有較高的臨床應用價值。

參考文獻：

[1]曹玉璞，葉元康.支原體與支原體病[M].北京人民衛生出版社，2000.

[2]汪寧，賀曉新，等.解脲脲原體分子流行病學研究[J].中國性病艾滋病防治，1999，5(4).

[3]任秀柳，鞠曉紅.解脲脲原體檢測方法研究進展[J].吉林醫藥學院學報，2008，29(3):174-176.

編輯/肖慧