奧美拉唑促進K562細胞凋亡作用的研究

摘要：目的初步探討奧美拉唑促進人白血病細胞系K562細胞凋亡的作用其作用機制。方法采用四唑藍（MTT）比色法觀察奧美拉唑對K562細胞的毒性作用，計算IC50、IC20值；臺盼蘭試驗測定在不同pH環境下奧美拉唑對K562細胞生長影響；Annexin V法檢測奧美拉唑處理后細胞凋亡變化。結果奧美拉唑對K562細胞的IC50值為127.031 μg/mL，IC20為59.315 μg/mL；奧美拉唑處理的細胞均出現藍染細胞，且隨著pH值的降低藍染細胞增多；奧美拉唑處理K562細胞24 h、48 h與空白對照值比較凋亡百分比明顯增加(P<0.05)；24 h、48 h同等劑量之間凋亡百分比比較也有差異(P<0.05)； Caspase家族抑制劑與奧美拉唑共處理K562細胞24 h與奧美拉唑單獨處理24 h后的凋亡百分比比較無明顯差異(P>0.05)。結論在含有一定濃度的奧美拉唑的酸性環境中K562細胞生存率大大降低；一定濃度的奧美拉唑能夠促進K562細胞凋亡，呈劑量時間依賴性；奧美拉唑促K562細胞凋亡是非Caspases途徑。

關鍵詞：奧美拉唑；K562細胞；細胞凋亡早在1965年，Warbury提出腫瘤細胞能夠進行很強的無氧酵解獲得能量，產生大量H+和乳酸[1]。惡性實體腫瘤組織內微環境不同程度的存在著的低pH、低O2，其將導致腫微環境酸化。缺氧和細胞外微環境酸化不利于腫瘤細胞凋亡，降低了腫瘤的化療效果。質子泵抑制劑如奧美拉唑是標準治療酸相關疾病的藥物，其需要一個酸性環境才能發揮活性[2]，而腫瘤細胞微環境酸化為質子泵抑制劑發揮作用提供有利場所。因此，我們推測通過質子泵抑制劑逆轉腫瘤細胞的異常酸環境，破壞腫瘤細胞重要的內環境穩定機制，從而導致細胞死亡。

1資料與方法

1.1一般資料 RPMI1640購于美國Gibco公司；奧美拉唑購于阿斯利康制藥有限公司，Z-VAD-FMK購于瑞士Alexis公司，0.4%臺盼蘭購于美國Invitrogen公司，MTT購于上海華舜生物工程有限公司，Annexin V檢測試劑盒購于美國BD公司，人白血病細胞K562購自中國科學院上海細胞研究所。

1.2 MTT法測定奧美拉唑對K562的細胞毒作用 將對數生長期K562細胞制成單細胞懸液，接種于24孔板上（每孔1 mL）。每孔加入奧美拉唑（終濃度為40、80、120、200、300 μg/mL），再依次接入96孔板，每個濃度級設3個復孔，培養48 h后每孔加MTT(5 mg/L) 20 μL，繼續孵育4 h，后每孔加DMSO 100 μL，在490 nm波長的酶聯免疫測定儀上檢測吸光度(A)值，實驗重復3次，取3次的平均值，計算奧美拉唑對K562的IC50、IC20值。

1.3臺盼蘭試驗測定在不同pH下奧美拉唑對K562細胞生長影響：將對數生長期K562細胞分別接種在pH為7.0、6.5、6.0、5.5、5.0的細胞培養液中，至24孔板上（每孔1 mL）。實驗分為兩部分：①細胞不予任何處理，②細胞加入終濃度為50 μg/mL的奧美拉唑，培養24 h后收集細胞，加入0.4%臺盼蘭，5 min后計數記錄藍染及未染色細胞數目，實驗重復3次。

1.4流式細胞儀檢測奧美拉唑處理后細胞凋亡 K562細胞制成單細胞懸液，接種于6孔板上(2 mL/孔)。每孔中加入奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400 μg/mL），每個濃度級設3個復孔。培養24 h后收集部分細胞（其余細胞培養48 h時收集），用4.0℃預冷的PBS洗滌2次，用1×blot Buffer重懸細胞。各加入Annexin V 10 μL，PI 20 μL，另設空白對照，FITC對照(只加入Annexin V 10 μL)，PI對照(只加入PI 20 μL)，常溫避光孵育15 min。洗滌細胞后上流式細胞儀檢測凋亡細胞。

1.5 Caspase家族抑制劑對K562細胞凋亡影響 將對數生長期K562細胞制成單細胞懸液，接種于6孔板上（2 mL/孔）。每孔中加入Z-VAD-FMK 2 μL，并加入奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400μg/ml），每個濃度級設3個復孔。培養24 h后收集細胞，用4.0℃預冷的PBS洗滌2次，用1×blot Buffer重懸細胞。各加入Annexin V 10 μL，PI 20 μL，另設空白對照，FITC對照(只加入Annexin V μL)，PI對照(只加入PI 20 μL)，常溫避光孵育15 min。洗滌細胞后檢測凋亡細胞。

1.6統計學處理 用SPSS 11.5軟件進行統計分析，結果以均數±標準差（x±s）表示，采用方差分析和兩組資料比較的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1奧美拉唑對K562的細胞毒作用 奧美拉唑對K562細胞的IC50值為（127.031±0.031）μg/mL，IC20為（59.315±0.063） μg/mL。選取無細胞毒性作用的50 μg/mL奧美拉唑濃度進行后續實驗。

2.2不同pH環境下奧美拉唑對K562細胞生長影響 在不同pH值的細胞培養液中培養K562細胞24 h后采用臺盼蘭試驗測定細胞活力，幾乎未見藍染細胞；而加入奧美拉唑的細胞組出現不同程度的藍染細胞，且隨著pH的降低藍染細胞增多。

2.3奧美拉唑處理后細胞凋亡情況 空白對照K562細胞凋亡百分比為(0.757±0.006)%，奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400 μg/mL）處理K562細胞24 h凋亡百分比依次為(18.960±0.282)%、(49.367±1.233)%、(75.510±0.958)%、(90.657±0.398)% (n=3)；與空白對照值比較凋亡百分比明顯增加(P<0.05)。48 h凋亡百分比依次為(28.073±0.445)%、(60.773±0.545)%、(83.257±0.635)%、(93.997±0.095)% (n=3)；與空白對照值比較凋亡百分比明顯增加(P<0.05)，且與同等劑量24 h的凋亡百分比比較也有差異(P<0.05)。見表1。

2.4 Caspase家族抑制劑對K562細胞凋亡影響 Z-VAD-FMK 2 μL與奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400 μg/mL）共處理K562細胞24 h，凋亡百分比依次為(18.843±0.075)%、(48.233±0.150)%、(74.073±0.825)%、(90.777±0.188)% (n=3)；與未加Caspase家族抑制劑的同等劑量奧美拉唑處理24 h后的凋亡百分比比較無明顯差異(P>0.05)，見表1。

3討論

近10年來，人們研究發現，惡性腫瘤細胞是通過破壞正常細胞維持內環境穩定的相關功能而逐漸演變來的。這些功能與控制細胞增殖、侵犯能力、抵抗抗腫瘤劑有關。實際上，在正常組織的細胞外pH是中性的，腫瘤細胞的間質是酸性的，由于這個特點，腫瘤細胞具有兩個pH梯度特征：細胞溶質與細胞外基質存在一個pH梯度，細胞溶質與細胞內空腔小囊泡存在一個pH梯度。為了避免在這種特征性的環境中腫瘤細胞內酸化，腫瘤細胞有著增強的pH調節功能，其泌酸活性增強，細胞內pH與正常細胞無明顯差異，使得腫瘤細胞逃避凋亡。

細胞凋亡[3]是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，1972年由Kerr教授首先提出的。細胞凋亡途徑大家公認的是Caspases途徑。然而，近兩年國內外很多學者研究發現細胞凋亡還存在著非Caspases依賴途徑。例如：東京大學腫瘤細胞研究所研究員也研究[4]提出綠茶的一種成分兒茶素也是通過非Caspases依賴途徑誘導人類慢性髓細胞白血病細胞K562凋亡。

Marie Yeo等人體外實驗發現[5]在含質子泵抑制劑的酸性環境中胃癌細胞株生存率大大降低，質子泵抑制劑可以選擇性的使胃癌細胞凋亡，呈時間劑量依賴性。而正常胃粘膜上皮細胞在上述環境中可產生HSP70，HSP27抵抗凋亡，達到細胞保護作用。本實驗中，我們觀察了不同pH的培養基中加入無細胞毒性劑量的奧美拉唑作用K562細胞，發現隨著pH的降低，死亡細胞增多。而未用奧美拉唑處理過的K562細胞能在酸性環境中存活。說明在含有奧美拉唑的酸性環境中K562細胞生存率大大降低。后續實驗表明一定濃度的奧美拉唑能夠促進K562細胞凋亡，且隨著奧美拉唑濃度的增加K562細胞凋亡率增高。48 h與24 h的同濃度級比較隨著時間的延長K562細胞的凋亡也增高。結果表明奧美拉唑能夠促進K562細胞凋亡，呈劑量時間依賴性。對于奧美拉唑促進K562細胞凋亡的途徑，我們作了初步的檢測：在奧美拉唑處理K562細胞的同時，加入Caspases家族抑制劑Z-VAD-FMK共同培養。發現加入Caspases家族抑制劑后，奧美拉唑促K562細胞凋亡并無減弱。結果提示奧美拉唑促進K562細胞的凋亡作用并非通過Caspases途徑，可能存在著其他的途徑誘導凋亡。

綜上所述，作為臨床治療胃酸疾病的一線藥物質子泵抑制劑奧美拉唑，能夠抑制質子泵的泌酸功能。在腫瘤細胞株中我們發現一定濃度的奧美拉唑能夠促K562腫瘤細胞凋亡，且為時間劑量依賴性。而凋亡途徑初步研究是非Caspases途徑。本實驗中我們只是對奧美拉唑抗白血病K562細胞株做了初步的研究，在今后的工作中，我們將繼續更深入的探討奧美拉唑其促進K562細胞凋亡的機制是什么。如果能獲得突破，將為臨床提高白血病療效提供理論依據及方案，大大的提高白血病治療的有效率。

參考文獻：

[1]金潔，覃文新，楊勝利.質子泵抑制劑與腫瘤耐藥研究[J].生命科學，2007，19:09-13.

[2]Besancon M，Simon A，Sachsg，et al．Sites of reaction of the gastric H+，K+-ATPase with extracytoplasmic thiol reagents[J].Journal of Biological Chemistry，1997，272:438-446．

[3]李超，伏圣博，劉華玲，等．細胞凋亡研究進展[J]．世界科技研究與發展，2007，29:45-53．

[4]Iwasaki R，Ito K，Ishida T，et al．Catechin，green tea component，causes caspase-independent necrosis-like cell death in chronic myelogenous leukemia[J].Cancer Sci，2009，100:349-356．

[5]Yeo M，Kim D，Kim Y，et al．Selective Induction of Apoptosis with Proton Pump Inhibitor in Gastric Cancer Cells[J].Clinical Cancer Research，2004，10:8687-8696．編輯/肖慧