奧美拉唑促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡作用的研究

摘要：目的初步探討奧美拉唑促進(jìn)人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞凋亡的作用其作用機(jī)制。方法采用四唑藍(lán)（MTT）比色法觀察奧美拉唑?qū)562細(xì)胞的毒性作用，計(jì)算IC50、IC20值；臺(tái)盼蘭試驗(yàn)測(cè)定在不同pH環(huán)境下奧美拉唑?qū)562細(xì)胞生長(zhǎng)影響；Annexin V法檢測(cè)奧美拉唑處理后細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果奧美拉唑?qū)562細(xì)胞的IC50值為127.031 μg/mL，IC20為59.315 μg/mL；奧美拉唑處理的細(xì)胞均出現(xiàn)藍(lán)染細(xì)胞，且隨著pH值的降低藍(lán)染細(xì)胞增多；奧美拉唑處理K562細(xì)胞24 h、48 h與空白對(duì)照值比較凋亡百分比明顯增加(P<0.05)；24 h、48 h同等劑量之間凋亡百分比比較也有差異(P<0.05)； Caspase家族抑制劑與奧美拉唑共處理K562細(xì)胞24 h與奧美拉唑單獨(dú)處理24 h后的凋亡百分比比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論在含有一定濃度的奧美拉唑的酸性環(huán)境中K562細(xì)胞生存率大大降低；一定濃度的奧美拉唑能夠促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡，呈劑量時(shí)間依賴性；奧美拉唑促K562細(xì)胞凋亡是非Caspases途徑。

關(guān)鍵詞：奧美拉唑；K562細(xì)胞；細(xì)胞凋亡早在1965年，Warbury提出腫瘤細(xì)胞能夠進(jìn)行很強(qiáng)的無(wú)氧酵解獲得能量，產(chǎn)生大量H+和乳酸[1]。惡性實(shí)體腫瘤組織內(nèi)微環(huán)境不同程度的存在著的低pH、低O2，其將導(dǎo)致腫微環(huán)境酸化。缺氧和細(xì)胞外微環(huán)境酸化不利于腫瘤細(xì)胞凋亡，降低了腫瘤的化療效果。質(zhì)子泵抑制劑如奧美拉唑是標(biāo)準(zhǔn)治療酸相關(guān)疾病的藥物，其需要一個(gè)酸性環(huán)境才能發(fā)揮活性[2]，而腫瘤細(xì)胞微環(huán)境酸化為質(zhì)子泵抑制劑發(fā)揮作用提供有利場(chǎng)所。因此，我們推測(cè)通過(guò)質(zhì)子泵抑制劑逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的異常酸環(huán)境，破壞腫瘤細(xì)胞重要的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定機(jī)制，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

1資料與方法

1.1一般資料 RPMI1640購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；奧美拉唑購(gòu)于阿斯利康制藥有限公司，Z-VAD-FMK購(gòu)于瑞士Alexis公司，0.4%臺(tái)盼蘭購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，MTT購(gòu)于上海華舜生物工程有限公司，Annexin V檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司，人白血病細(xì)胞K562購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.2 MTT法測(cè)定奧美拉唑?qū)562的細(xì)胞毒作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于24孔板上（每孔1 mL）。每孔加入奧美拉唑（終濃度為40、80、120、200、300 μg/mL），再依次接入96孔板，每個(gè)濃度級(jí)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后每孔加MTT(5 mg/L) 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，后每孔加DMSO 100 μL，在490 nm波長(zhǎng)的酶聯(lián)免疫測(cè)定儀上檢測(cè)吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次的平均值，計(jì)算奧美拉唑?qū)562的IC50、IC20值。

1.3臺(tái)盼蘭試驗(yàn)測(cè)定在不同pH下奧美拉唑?qū)562細(xì)胞生長(zhǎng)影響：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞分別接種在pH為7.0、6.5、6.0、5.5、5.0的細(xì)胞培養(yǎng)液中，至24孔板上（每孔1 mL）。實(shí)驗(yàn)分為兩部分：①細(xì)胞不予任何處理，②細(xì)胞加入終濃度為50 μg/mL的奧美拉唑，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，加入0.4%臺(tái)盼蘭，5 min后計(jì)數(shù)記錄藍(lán)染及未染色細(xì)胞數(shù)目，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)奧美拉唑處理后細(xì)胞凋亡 K562細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板上(2 mL/孔)。每孔中加入奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400 μg/mL），每個(gè)濃度級(jí)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后收集部分細(xì)胞（其余細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)收集），用4.0℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，用1×blot Buffer重懸細(xì)胞。各加入Annexin V 10 μL，PI 20 μL，另設(shè)空白對(duì)照，F(xiàn)ITC對(duì)照(只加入Annexin V 10 μL)，PI對(duì)照(只加入PI 20 μL)，常溫避光孵育15 min。洗滌細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.5 Caspase家族抑制劑對(duì)K562細(xì)胞凋亡影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板上（2 mL/孔）。每孔中加入Z-VAD-FMK 2 μL，并加入奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400μg/ml），每個(gè)濃度級(jí)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用4.0℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，用1×blot Buffer重懸細(xì)胞。各加入Annexin V 10 μL，PI 20 μL，另設(shè)空白對(duì)照，F(xiàn)ITC對(duì)照(只加入Annexin V μL)，PI對(duì)照(只加入PI 20 μL)，常溫避光孵育15 min。洗滌細(xì)胞后檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析和兩組資料比較的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1奧美拉唑?qū)562的細(xì)胞毒作用 奧美拉唑?qū)562細(xì)胞的IC50值為（127.031±0.031）μg/mL，IC20為（59.315±0.063） μg/mL。選取無(wú)細(xì)胞毒性作用的50 μg/mL奧美拉唑濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2不同pH環(huán)境下奧美拉唑?qū)562細(xì)胞生長(zhǎng)影響 在不同pH值的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)K562細(xì)胞24 h后采用臺(tái)盼蘭試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力，幾乎未見(jiàn)藍(lán)染細(xì)胞；而加入奧美拉唑的細(xì)胞組出現(xiàn)不同程度的藍(lán)染細(xì)胞，且隨著pH的降低藍(lán)染細(xì)胞增多。

2.3奧美拉唑處理后細(xì)胞凋亡情況 空白對(duì)照K562細(xì)胞凋亡百分比為(0.757±0.006)%，奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400 μg/mL）處理K562細(xì)胞24 h凋亡百分比依次為(18.960±0.282)%、(49.367±1.233)%、(75.510±0.958)%、(90.657±0.398)% (n=3)；與空白對(duì)照值比較凋亡百分比明顯增加(P<0.05)。48 h凋亡百分比依次為(28.073±0.445)%、(60.773±0.545)%、(83.257±0.635)%、(93.997±0.095)% (n=3)；與空白對(duì)照值比較凋亡百分比明顯增加(P<0.05)，且與同等劑量24 h的凋亡百分比比較也有差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 Caspase家族抑制劑對(duì)K562細(xì)胞凋亡影響 Z-VAD-FMK 2 μL與奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400 μg/mL）共處理K562細(xì)胞24 h，凋亡百分比依次為(18.843±0.075)%、(48.233±0.150)%、(74.073±0.825)%、(90.777±0.188)% (n=3)；與未加Caspase家族抑制劑的同等劑量奧美拉唑處理24 h后的凋亡百分比比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

3討論

近10年來(lái)，人們研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細(xì)胞是通過(guò)破壞正常細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的相關(guān)功能而逐漸演變來(lái)的。這些功能與控制細(xì)胞增殖、侵犯能力、抵抗抗腫瘤劑有關(guān)。實(shí)際上，在正常組織的細(xì)胞外pH是中性的，腫瘤細(xì)胞的間質(zhì)是酸性的，由于這個(gè)特點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞具有兩個(gè)pH梯度特征：細(xì)胞溶質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)存在一個(gè)pH梯度，細(xì)胞溶質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)空腔小囊泡存在一個(gè)pH梯度。為了避免在這種特征性的環(huán)境中腫瘤細(xì)胞內(nèi)酸化，腫瘤細(xì)胞有著增強(qiáng)的pH調(diào)節(jié)功能，其泌酸活性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)pH與正常細(xì)胞無(wú)明顯差異，使得腫瘤細(xì)胞逃避凋亡。

細(xì)胞凋亡[3]是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，1972年由Kerr教授首先提出的。細(xì)胞凋亡途徑大家公認(rèn)的是Caspases途徑。然而，近兩年國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡還存在著非Caspases依賴途徑。例如：東京大學(xué)腫瘤細(xì)胞研究所研究員也研究[4]提出綠茶的一種成分兒茶素也是通過(guò)非Caspases依賴途徑誘導(dǎo)人類(lèi)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞K562凋亡。

Marie Yeo等人體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[5]在含質(zhì)子泵抑制劑的酸性環(huán)境中胃癌細(xì)胞株生存率大大降低，質(zhì)子泵抑制劑可以選擇性的使胃癌細(xì)胞凋亡，呈時(shí)間劑量依賴性。而正常胃粘膜上皮細(xì)胞在上述環(huán)境中可產(chǎn)生HSP70，HSP27抵抗凋亡，達(dá)到細(xì)胞保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了不同pH的培養(yǎng)基中加入無(wú)細(xì)胞毒性劑量的奧美拉唑作用K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著pH的降低，死亡細(xì)胞增多。而未用奧美拉唑處理過(guò)的K562細(xì)胞能在酸性環(huán)境中存活。說(shuō)明在含有奧美拉唑的酸性環(huán)境中K562細(xì)胞生存率大大降低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明一定濃度的奧美拉唑能夠促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡，且隨著奧美拉唑濃度的增加K562細(xì)胞凋亡率增高。48 h與24 h的同濃度級(jí)比較隨著時(shí)間的延長(zhǎng)K562細(xì)胞的凋亡也增高。結(jié)果表明奧美拉唑能夠促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡，呈劑量時(shí)間依賴性。對(duì)于奧美拉唑促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡的途徑，我們作了初步的檢測(cè)：在奧美拉唑處理K562細(xì)胞的同時(shí)，加入Caspases家族抑制劑Z-VAD-FMK共同培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)加入Caspases家族抑制劑后，奧美拉唑促K562細(xì)胞凋亡并無(wú)減弱。結(jié)果提示奧美拉唑促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡作用并非通過(guò)Caspases途徑，可能存在著其他的途徑誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，作為臨床治療胃酸疾病的一線藥物質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑，能夠抑制質(zhì)子泵的泌酸功能。在腫瘤細(xì)胞株中我們發(fā)現(xiàn)一定濃度的奧美拉唑能夠促K562腫瘤細(xì)胞凋亡，且為時(shí)間劑量依賴性。而凋亡途徑初步研究是非Caspases途徑。本實(shí)驗(yàn)中我們只是對(duì)奧美拉唑抗白血病K562細(xì)胞株做了初步的研究，在今后的工作中，我們將繼續(xù)更深入的探討奧美拉唑其促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制是什么。如果能獲得突破，將為臨床提高白血病療效提供理論依據(jù)及方案，大大的提高白血病治療的有效率。

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