脊髓和背根神經節免疫組化制片的實踐和體會

免疫組織化學ABC法是一種古老而經典的染色技術，由于敏感性高，操作時間短而被廣泛使用，也是研究生最常用的實驗方法之一[1]。免疫組化制片過程包括灌注、取材、切片和染色四個部分，任何一個環節的失誤都會影響到最終片子的質量，從而影響實驗結果的展示。作者在研究生期間采用ABC法進行了大量大鼠脊髓和背根神經節（DRG）冰凍切片的免疫組化染色實驗，通過重視操作的每一個環節，改良優化一些細節，使制作出的脊髓片和DRG片質量大為提高，實驗結果更為精準、美觀。以下是在實驗中總結出的一些心得體會。

1灌注的好壞直接影響了固定的質量。

灌注是免疫組化實驗的第一步，主要包括兩個環節：灌注液的配制和灌注時的操作。

在我們實驗中通常配制含4%多聚甲醛的PB緩沖液作為灌注液，一般都能有較好的固定效果。但如果發現灌注后大鼠四肢不硬或取材脊髓太軟時，可通過在灌注液中添加50~75%的飽和苦味酸，增加灌注液的組織穿透性和增強組織韌性來解決。我們早期實驗中曾使用過一只十分難染的抗體TRPV4，在DRG中染色很多次都沒有陽性結果。一次降低灌注液的濃度至2%后，可見有明顯的陽性染色出現，因此適當降低灌注液的甲醛濃度，是一種針對難染抗原的方法之一。

做好準備工作后就可以進行灌注了，此過程并不復雜，但如果操作不慎，也會導致灌注失敗，浪費辛苦所得的模型動物。在我們實驗中會注意以下一些細節，通常都能取得較高質量的固定效果。①灌注前務必要徹底排盡管子內的空氣和氣泡，這樣做主要是為了防止空氣栓塞于小血管，影響灌流液與組織的充分接觸。②在暴露心臟和升主動脈根部時不僅速度要快，而且視野要充分，盡量在心臟停跳后不久即完成灌注，促進灌注液的流動。另外，穿刺時可先在心尖處剪一小口，這樣不僅能減少穿刺時的阻力，防止組織堵塞針頭，也可降低因血容量急劇增多引起末梢微血管破裂。同時應注意穿刺時，針頭尖端進入升主動脈內1~2 mm即可（大鼠），不宜過長，以免因針頭頂住血管壁而增加灌流阻力；也不宜過短，否則部分灌注液可能會從心臟剪開的部位漏掉。③當灌注液進入體內后，大鼠出現四肢明顯抽搐，肝臟發白，以及內臟鼓起即表明灌注成功。如果初次灌注或操作不熟練造成組織固定效果不好時，可將組織置于灌注時的同一灌注液中4~6 h，進行后固定以增加固定效果，但后固定的時間不要超過24 h，否則會形成結晶，影響染色結果。

2取材時組織的完整性對于標本的美觀十分重要。

脊髓取材相對較為簡單，注意操作時器械尖端緊貼椎骨一點點掀開骨片，避免劃傷組織即可。但是DRG由于位于椎間孔內，標本小且位置深，直接去椎骨取材常易損傷DRG組織。因此，我們采用沿坐骨神經逆行追蹤L4和L5神經至椎間孔，再沿神經走行方向用力將DRG從椎間孔拉出的方式進行取材，這樣既能保證DRG結構的完整性，在熟練掌握的基礎上也相對簡單易行。而且即使神經被拉斷，仍可通過掀開椎骨的方式取出DRG。需注意的是：如同時需要脊髓組織時，務必先取脊髓后拉DRG，否則會因牽拉對脊髓組織造成一定的損傷。

取材后的脊髓或DRG需在30%的蔗糖溶液中放置至組織沉底，目的是將組織中的水分充分置換出，以減少在冰凍時形成冰晶損傷組織。但蔗糖溶液易生霉菌，若要較長時間保存組織則必須在溶液中加入0.03%的疊氮鈉，否則會使組織發生霉變而無法使用。

3切片的質量是染色的前提。

神經組織多采用冰凍切片。由于在組織凍結過程中，細胞內、外的水分都會形成冰晶，且凍結速度越慢，形成的冰晶越大，對組織和細胞形態結構的損害也就越嚴重。因此我們會在凍結前將組織浸埋于OCT包埋劑中，再速凍到-20℃，以達到盡量減少冰晶形成，且支撐組織的目的。在此過程中，包埋劑的使用既不能過多也不能太少，太少不能起到對組織的支撐作用，使切片時組織容易出現皺褶或碎裂，但太多也會增加切片后的漂洗過程，更為重要的是由于包埋劑和組織的硬度不同，容易在切片過程中帶離部分或全部組織，造成切片失敗。

脊髓的實驗常采用連續冠狀切片，而DRG因組織小，為了得到最大組織截面通常采用矢狀切片，且將片厚減小到10 μm以增加切片數量。但是由于切片薄，面積小且纖維較多，如果像脊髓片那樣進行漂片染色，則可能會因漂洗過程反復挑起組織而造成損傷，而且染色結束后很難保證DRG片的平整，影響鏡下觀察。因此在我們的實驗中DRG片均是在切片后即貼片。不僅如此，我們還進行連續貼片，通常一個大鼠的DRG可以連續貼出6張載玻片，每張玻片上4~5個DRG片，這樣做目的是為了得到6套結構基本相似的DRG玻片，有利于進行相似結構不同抗體的對比實驗。然而，貼片染色最大的問題就在于反復漂洗等過程中容易脫片，因此對載玻片的前期處理就顯得格外重要。我們實驗中對新購的載玻片依次要經過泡酸、自來水清洗、洗潔精搓洗、雙蒸水清洗、逐一掛膠、烤干、再逐一掛膠、再烤干等步驟，目的是使載玻片具有較好的粘附性；在使用時要挑選光潔無膠痕的掛膠片用來貼片，只有這樣才能盡可能地減少脫片的幾率。此外，如果經費充足，也可直接購買用賴氨酸包被好的載玻片進行貼片。

4染色的質量直接決定了免疫組化的結果。

染色是免疫組化制片過程中的最后一步，也是最關鍵的一步。為了保證染色的效果，我們通常會將標本進行預處理：用H2O2去除組織中的過氧化物酶，以及用血清封閉非特異性抗原。但需注意H2O2處理時應注意時間和避光，若長時間H2O2浸泡，會使組織易破碎，而不避光則會使H2O2分解失效。

預處理之后就是加入抗體進行染色的步驟了，該過程一般需經3次抗體孵育，其中第一抗體最為重要，它將特異性地結合組織中的抗原。由于通常購買的第一抗體大多都是多克隆抗體，往往會出現非特異性染色，因此確定抗體染色最佳濃度就顯得至關重要。那么如何確定抗體最佳濃度呢？最簡單的方法當然是借鑒前人的使用結果。但很多時候實驗中會使用到新購抗體，這時就只能采用抗體梯度稀釋染色的方法，篩選出染色效果最好的抗體工作濃度進行后續實驗。另外在染色過程中還需注意抗體的孵育時間。第一抗體的孵育時間通常<24 h，生物素結合的二抗6~8 h，AB復合物則2 h左右即可。然而對于一些不易染出的抗體，可將孵育時間均適當延長，如一抗延長至72 h，以增加抗體與抗原的充分作用。但是孵育時間長，非特異性染色也會增多，為此最好在4℃條件下孵育抗體（除AB復合物外），這樣在增加抗體作用時間的同時并不會增強染色背底。

抗體孵育后的顯色一般是用DAB作用5~10 min，并加入少量H2O2加速反應。此過程中H2O2的加入應少量多次逐步加入，這樣顯色才能均勻；此外若無陽性結果時也不必過度延長DAB顯色時間，因加入DAB后一段時間，陽性產物是不會隨著時間延長而繼續增多的。

5實驗中主要存在的問題和解決辦法

對脊髓片和DRG片免疫組化制片實驗中的問題進行總結，主要包括兩個方面：①沒有陽性結果：可能原因主要有抗體質量不好或工作濃度不合適、標本放置時間太久等。除了抗體質量問題外，其余都可在實驗中通過摸索條件來解決。而抗體質量不好則最難解決，可先通過降低灌注液濃度、對組織進行抗原修復、延長抗體孵育時間或適當提高抗體濃度等方法，若仍舊無法染出陽性結果，則最好盡快更換抗體，以免浪費實驗時間。②有陽性結果但質量不好：質量不好分為兩種：一種是標本中出現明顯空洞或標本殘缺，這可能是浸糖時間不夠，蔗糖脫水不充分；或取材、漂片時動作過于粗暴所致，這些問題比較容易解決。而另一種則是出現假陽性、非特異性染色或對比度不好等，這通常是因第一抗體工作濃度過高、漂洗不充分、血清封閉不夠或DAB反應時間太長所致，因此預實驗就顯得格外重要。

免疫組化ABC法雖然技術古老，操作簡單，然而要得到高質量的脊髓片或DRG片，卻并非易事。研究生在實驗中應重視細節操作，在掌握原理的基礎上進行合理改良，不僅能得到滿意的實驗結果，也能更好地培養和提高研究生的科研素質。

參考文獻：

[1] 李云慶. 神經解剖學[M]. 西安:第四軍醫大學出版社， 2011: 60-66.

編輯/王海靜