TRFIA與ELISA法檢測乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物注意事項

摘要：為了保證時間分辨免疫熒光法( TRFIA) 和酶聯(lián)免疫吸附試驗( ELISA) 對乙型肝炎病毒標(biāo)志物檢測的質(zhì)量控制，本文分別分析了兩種檢測方法的各自特點和注意事項，有助于檢測人員對分析檢測結(jié)果是否受到干擾提高判斷和處理干擾因素的能力，保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：TRFIA; ELISA; 乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物；注意事項

TRFIA and ELISA Serological Markers for the Detection of HBV

GUO Yi

(Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530000，Guangxi，China)

Abstract：In order to ensure the time-resolved fluorescence immunoassay (TRFIA) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the quality control of hepatitis B virus marker detection， this paper analyzed the characteristics of two kinds of detection method and the matters needing attention， helps to detect personnel on the analysis of results in detection of whether interference and improve judgment processing of interference factors， to ensure the accuracy of test results.

Key words： TRFIA; ELISA; Hepatitis B virus serum markers; Matters needing attention乙肝是一種常見的肝病，ＨＢＶ的早期發(fā)現(xiàn)與確診，臨床主要依據(jù)實驗室肝炎病毒標(biāo)志物的檢測，ＨＢＶ檢測目前實驗室檢測血清乙肝兩對半普遍使用時間分辨免疫熒光法( TRFIA) 和酶聯(lián)免疫吸附試驗( ELISA)，本文分別討論兩種檢測方法的各自特點和注意事項，可以幫助檢測人員在實驗過程中分析是否受到干擾提高判斷和處理干擾因素的能力，有效保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 TRFIA

是用獨特?zé)晒馓匦缘蔫|系稀土金屬及其螯合劑作為示蹤物，以此用來標(biāo)注抗體鄧這些活性細(xì)胞，也就是反應(yīng)體系，等待反應(yīng)體系發(fā)生之后，用時間來分辨螢光強(qiáng)度，用螢光強(qiáng)度的相對比值來確定這些反應(yīng)體系中的分析物的濃密度，靠這種方法來達(dá)到定量分析的目標(biāo)。 作為一種高靈敏度免疫學(xué)檢查技術(shù)，具有高靈敏度、高穩(wěn)定性、線性范圍寬、可定量等優(yōu)點，目前臨床使用越來越多地選擇 TRFIA 檢測乙肝標(biāo)志物，做好其的室內(nèi)質(zhì)量控制就顯得非常重要，總結(jié)以下幾點注意事項：

1.1 測量時要嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行操作，操作前儀器狀態(tài)自檢良好才可以檢測，每次檢測均進(jìn)行不少與5點定標(biāo)，每個標(biāo)點重復(fù)測定n次，取其平均值擬合劑量-反應(yīng)曲線計算結(jié)果，結(jié)果中標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)應(yīng)（r）值≥ 0.99。

1.2購買衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供的標(biāo)量質(zhì)控品，制作質(zhì)控圖，在儀器最佳條件下，對該批質(zhì)控品反復(fù)測定（至少20份），計算出20個結(jié)果的X、標(biāo)準(zhǔn)差S， X±2S作為上警戒限和下警戒限；X±3S作為控制圖的上控制限和下控制限，選擇質(zhì)控規(guī)則時必須兼顧在免疫學(xué)檢驗中常采用6個質(zhì)控規(guī)則，即12s，13s，22s，R4s，41s，10X質(zhì)控規(guī)則。失控，所謂的失控就是限定或超出某一規(guī)定范圍，這個范圍的界定是以12s規(guī)則作為警告規(guī)則啟動13s，22s，R4s，41s，10X系列質(zhì)控規(guī)則的，當(dāng)數(shù)據(jù)在范圍內(nèi)的，判斷為在控，當(dāng)數(shù)據(jù)在范圍之外的，判斷為失控，這個界定的規(guī)則也會出現(xiàn)誤差，當(dāng)系統(tǒng)的誤差太大時，就會由規(guī)則13s檢出。

1.3統(tǒng)計計算批內(nèi)、批間標(biāo)準(zhǔn)品檢測值，計算精密度，精密度要滿足方法的要求。

1.4計算測量過程中的不確定度。一切測量都不可避免地存在誤差，因此，一個完整的測量結(jié)果不僅要包含被測的數(shù)值和單位，還應(yīng)包含對測量結(jié)果的可信賴程度評定的數(shù)值。不確定度指的是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系[1]。分為A類和B類，不確定度計算要建立數(shù)學(xué)模式，主要來源: 樣品重復(fù)測量不確定度（A類），標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)曲線不確定度，分析儀器的不確定度。

2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

是一種常用的固相酶免疫測定方法，是在放射免疫分析理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性標(biāo)記免疫技術(shù)，具有簡便、快速、消耗成本低[2]，在很多基層試驗室仍然使用，這樣會就收到了方法學(xué)自身的限定，只能作為陰陽性方面的判斷，不能測到乙肝上面具體的兩對半的含有量。這個不可能作為動態(tài)學(xué)上感染的臨床觀察，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到診斷的效果。在這個測定中其他的不定性的干擾信號太多，并且這個也有技術(shù)含量在里面，會導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，干擾因素主要有標(biāo)本、試劑、人為操作三方面的原因，

2.1標(biāo)本采集①溶血:因Hb中富含有血紅素基因， 這種基因是一種過氧化物活性物質(zhì)， ELISA 是以HRP為標(biāo)記，如標(biāo)本中的Hb太多，容易吸附在固相與底物發(fā)生顯色反應(yīng)，假陽性結(jié)果出現(xiàn)；②標(biāo)本凝固性不好或放置時間太長，也會出現(xiàn)異常的效果；③細(xì)菌污染，采血試管清洗不夠干凈、 經(jīng)常使用會出現(xiàn)交叉性污染; 也可能造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管;④正常血液采集冷凍標(biāo)本反復(fù)凍融:這會使抗體效價下降；⑤干擾物質(zhì) 有人認(rèn)為大約４０％的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果，常見的干擾物質(zhì)有類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體/嗜異性抗體交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等，某些自身抗體都會影響結(jié)果造成假陽性[2]。

2.2試劑因素對于試劑來說，對試劑質(zhì)量的選擇也存在很大的關(guān)系，因為質(zhì)量對檢測水平起著重要的作用。選取時可以根據(jù)試劑的歷史性評價和以往的臨床上的效果，以及方法等多方面來篩選[3]。

2.3 操作因素存在問題：加樣量不準(zhǔn)確，孵育、洗板、顯色、結(jié)果判讀時間不準(zhǔn)，孵育溫度過高或過低，孵育環(huán)境未避光， 洗板不干凈，未做陰、陽對照及復(fù)查臨界及可疑標(biāo)本。工作中加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中， 減少受熱不均， 貼密封膜， 防止污物浸入，洗板檢測結(jié)果密切相關(guān)，注意避免孔與孔之間液體交叉污染，拍干，要注意配制好的洗滌液的有效期，不應(yīng)使用過期的洗滌液進(jìn)行洗滌。

總體看，ELISA比較適合臨床乙型肝炎的初篩，價格便宜；TRFIA法可以定量，對乙型肝炎病毒感染的診斷、分型、治療和療效評價具有重要作用，其靈敏度和準(zhǔn)確性較高，漏診發(fā)生率較低，檢測費用昂貴，所以在臨床上對于HBSAg選擇何種檢測方法，還要結(jié)合醫(yī)院和受檢者的實際情況進(jìn)行選擇。在檢測過程中檢驗人員除有高度責(zé)任心，熟練規(guī)范操作外，還要熟知檢測方法中的注意事項，懂得判斷檢測結(jié)果是否受到干擾，如何處理這些干擾因素，才能保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王支蘭.EL ISA 試驗的質(zhì)量控制[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2004， 31(11481) .

[2] 胥鳳.西藏高原地區(qū)應(yīng)用ELISA方法檢測乙肝兩對半的技術(shù)要點與常見問題探討[J].西藏科技2012.5.

[3]賈志遠(yuǎn)， 余陶， 田瑞光，等. 四種乙肝病毒表面抗原 ELISA 診斷試劑的評價[J] . 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志， 2006，20(4): 384 -386.編輯/王海靜