流式細胞儀檢測HLA-B27及其臨床意義

摘要：目的通過流式細胞術對人體外周血HLA-B27的檢測，來評價HLA-B27輔助臨床診斷強直性脊柱炎（AS）的應用價值。方法56例強直性脊柱炎患者和51例健康體檢者，用熒光標記的抗HLA-B27/CD3單克隆抗體與其外周血（以EDTA-K2抗凝）特異性結合，用流式細胞儀檢測其熒光強度來反映細胞表面HLA-B27抗原的表達。結果從流式細胞術檢測顯示，56例AS患者中，HLA-B27陽性51例，陽性率為91.1%；51例健康體檢者中，HLA-B27陽性3例，陽性率為5.9%。兩者存在顯著性差異，P<0.01。結論AS患者HLA-B27陽性率明顯高于正常人，所以檢測HLA-B27對強直性脊柱炎的診斷與鑒別診斷有著重要的意義。

關鍵詞：流式細胞儀；強直性脊柱炎；HLA-B27B27是HLA-B27位點上的一個重要的等位基因，其與許多疾病具有相關性，尤其是強直性脊柱炎；而且這種相關是迄今為止已知的HLA與疾病的關聯中最強和最典型的。目前，檢測HLA-B27的主要方法有補體依賴性微量淋巴細胞毒試驗、玫瑰花法、ELISA法、流式細胞術、PCR法等。其中以標準的NIH微量細胞毒法最為常用，這種方法操作簡便且準確性尚可，但是受細胞純度、補體差異、單抗效價及HLA高度多態性的影響，易出現漏診或假陽性(錯判、誤判)[1]。現在我們用熒光標記的單克隆抗體與人類白細胞表面抗原HLA-B27結合，用流式細胞儀來檢測其細胞表面的HLA-B27表達，現報告如下：

1資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1標本來源107例該院骨科門診及住院確診為AS的患者和健康體檢者。其中經臨床檢查和影像學檢查符合AS的患者56例，男38例，女18例，年齡18~77歲。健康體檢者51例，男27例，女24例，年齡23~82歲。取上述人員靜脈血2ml，EDTA-K2抗凝。

1.1.2 試劑美國Becton Dickinson公司HLA-B27 kit: HLA-B27-FITC (Clone GS145.2，IgG1 kappa)；CD3-PE(CloneSK7，IgG1 kappa)；HLA-B27 Calibration Bead；溶血劑(Lysing solution．1ys S) 批號為340183，洗滌液及鞘液用Coulter Isoton II血細胞稀釋液 批號為 8546733。

1.1.3 儀器美國Beckman CoulterEPICSXL-MCL型流式細胞儀

1.2方法

1.2.1 標本處理取HLA-B27-FITC/CD3-PE熒光抗體30ul、全血樣本50ul加入流式專用試管底部，混勻，置于室溫避光15min。加10倍稀釋后的溶血劑2ml，混勻，避光15min。1500r/min離心5min。棄上清液后用0.01N PBS洗滌兩次，上機測定。

1.2.2檢測與結果判斷①流式細胞儀校正使用Beckman Coulter公司的FLOW-CHECK校準光路 ②樣本檢測 取標準熒光微球1滴Calibration Bead，用1ml蒸餾水稀釋，測到一標準峰。分析已經處理好的樣本，選取以CD3-PE標記的淋巴細胞，并檢測這群細胞HLA-B27的中間熒光強度(Mdx)，若中間熒光強度大于標準微球峰熒光強度即為陽性，反之則為陰性

2結果

HLA-B27在強直性脊炎患者（AS）和健康體檢者中檢測結果如下：臨床診斷：AS患者例數：56例。陽性例數：51例。陽性率為91.1%，健康體檢者 例數：51例。陽性例數：3例。陽性率為5.9%

從上述結果可以看出，AS患者HLA-B27的陽性率高于健康體檢者的陽性率。

3討論

強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性、進行性和炎性疾病，主要累及骶骼關節、脊柱、脊柱軟組織及四肢關節，主要癥狀是腰、骶及下肢關節疼痛，晚期患者脊柱僵硬呈板狀，活動受限。HLA-B27與 AS 發病呈高度相關，其相關性為目前已知的HLA與疾病關系中關聯性最強和最典型的一種[2]。有研究表明，HLA-B27檢測可提高 X 線診斷AS 的陽性率，對AS早期尤其是X線表現不典型時具有良好的臨床應用價值[3]。

本實驗結果提示AS患者HLA-B27陽性率顯著高于正常人陽性率，但HLA-B27陽性不能診斷隨機選擇患者是否患有AS，因為非AS患者也有3%～7%的陽性率，但當臨床癥狀體征及影像學檢查懷疑有AS時HLA-B27陽性可作為診斷指標。如某患者診斷AS的可能性為50％，若患者陽性，則診斷AS的概率提高到95％左右；若該患者HLA-B27陰性，則患AS的概率降至3％左右。AS患者的臨床癥狀與類風濕性關節炎有相似之處，因此對確診為類風濕性關節炎的患者要進行B27的檢測，以免漏診。少兒患者因骶髂關節骨后未閉合，也給炎癥程度的判斷造成困難。所以，AS從發病到明確診斷往往需幾年時間。而B27檢測可以彌補上述不足，因此B27檢測可作為AS的篩選方法。

過去使用的血清學方法存在許多不足：要求用血量大，需無菌分離淋巴細胞，而且分離的淋巴細胞要有足夠的活性。所用抗血清為多克隆抗體，特異性較差，實驗不易標準化，分析所需時間較長，判斷通過記數死亡的淋巴細胞的方法，常含主觀人為因素影響。本實驗應用流式細胞術，根據直接熒光染色的原理，通過雙色直接免疫熒光單克隆抗體試劑抗HLA-B27-FITC／CD3-PE與成人外周血淋巴細胞特異性結合，使細胞具有一定的熒光強度，這種熒光強度可被流式細胞儀測得，從而判斷HLA-B27抗原陽性或陰性，同時可以根據熒光強弱的大小來進行判斷HLA-B27的表達情況，具有快速、簡單、特異性高的優點。

參考文獻：

[1]李維，府偉靈.流式細胞術檢測98例獻血者外周血HLA-B27的臨床意義[J]. 第三軍醫大學學報第，25(8):727-729.

[2]焦敏，侯衛紅.HLA-B27與強直性脊柱炎的相關性研究進展[J].中國優生與遺傳雜志，2011，19(4):6-8.

[3]巫翠萍，覃西，趙蓮.HLA-B27在診斷早期強直性脊椎炎中的應用價值[J].海南醫學，2011，22(23):19-21.

編輯/孫杰