維生素C對蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本收縮性的影響

摘 要：維生素C又名抗壞血酸，是白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，味酸，久置顏色逐漸變微黃；受光照則逐漸變褐，干燥狀態(tài)下在空氣中相當(dāng)穩(wěn)定，但在空氣存在下于溶液中則迅速變質(zhì)，pH值3.4～4.5時較穩(wěn)定。在水中易溶，在乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。閃點99℃；熔點187℃～192℃，熔融時同時分解。呈強還原性，有抑制多酚氧化酶作用。

關(guān)鍵詞：材料；步驟；方法；

中圖分類號：R741 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-3520（2014）-12-00-02

動物生理學(xué)研究顯示，近幾十年來為如何提高畜產(chǎn)品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，為不同的動物，提供不同的營養(yǎng)配方，進一步利用智能化的計算機對動物個體進行診斷并給予營養(yǎng)配方，運用飼養(yǎng)成果的檢測與評價，調(diào)整飼料營養(yǎng)配方，以達到提高畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量，預(yù)防和治療疾病的效果，提高人們生活水平的研究越來越多。

維生素C一般有以下幾種存在方式，維生素C[英文名：Vitamin C （L-Ascorbic acid）]、維生素C 100目（百目維生素C）、維生素C顆粒[維生素C-DC97]等等。本實驗采用的是維生素C顆粒。詳細信息如下：白色至微黃色固體顆粒，是由維生素C和淀粉按一定比例制成，作用與維生素C基本相同，維生素C顆粒具有較好的流動性、可壓性和易混合性，色澤穩(wěn)定，用于口服和咀嚼片的直接壓制，也可用于維生素礦物質(zhì)復(fù)合片的壓制，性狀白色至微黃色固體顆粒：砷≤0.0003%，重金屬（以Pb計）≤0.001%，干燥失重≤0.20%，含量96%～98%。

肌細胞疲勞的詳細機制尚不完全清楚，目前認(rèn)為可能與下列因素有關(guān)。

能源物質(zhì)耗竭 劇烈運動后肌肉之所以出現(xiàn)疲勞，原因之一是由于能源物質(zhì)的耗竭。從肌肉收縮的細胞學(xué)機制可以看出，肌肉的收縮和舒張都有賴于三磷酸腺苷，因此三磷酸腺苷的缺乏將導(dǎo)致肌肉收縮和舒張功能的障礙。但研究證實[6]，甚至在高強度運動疲勞時細胞內(nèi)的三磷酸腺苷也很有下降到運動前水平的70%以下，因此認(rèn)為運動疲勞的原因不在于三磷酸腺苷本身，可能是由于其他原因降低了三磷酸腺苷酶的活性使其利用率降低，或是由于三磷酸腺苷再合成時的后備能源。

一、實驗材料

選用規(guī)格相近，色彩鮮艷，健康活潑的蛙30只，Pclab-UE生物醫(yī)學(xué)信號采集儀，蛙類解剖器械，任氏液、維生素C。

二、方法及步驟

（一）分組

選用規(guī)格相近，色彩鮮艷，健康活潑的蛙30只，經(jīng)典方法制備腓腸肌標(biāo)本，分別置于25℃的維生素C濃度分別為0mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L、4.0 mmol/L 、5.0 mmol/L 、6.0 mmol/L 、7.0 mmol/L的任式液中浸泡5分鐘待測。

（二）蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本制作

1、分離坐骨神經(jīng) 取一條腿放置在蛙板上，用一根固定針將粗制標(biāo)本的脊柱固定在蛙板上（腹面朝上），將下肢拉直并向外旋轉(zhuǎn)趾蹼朝上，用固定針在跖骨部固定在蛙板上，用玻璃分針沿脊柱旁游離坐骨神經(jīng)至尾骨處、再循坐骨神經(jīng)溝（股二頭肌和半膜肌之間的裂逢處），找出坐骨神經(jīng)的大腿段，用玻璃分針仔細剝離，剪斷坐骨神經(jīng)的所有分支，并將神經(jīng)分離直至膝關(guān)節(jié)處。

2、分離腓腸肌 用玻璃分針或鑷子將腓腸肌跟腱分離，并穿線結(jié)扎。在結(jié)扎遠端用粗剪刀剪斷跟腱，左手執(zhí)線提起腓腸肌，以手術(shù)剪刀剪去其周圍聯(lián)系的組織，但保留腓腸肌起始點與骨的聯(lián)系，唯須注意勿損傷支配該肌的神經(jīng)分支。

3、游離坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本 將該后肢股部所有肌肉從膝關(guān)節(jié)起沿股骨剝離并剪去，以粗剪刀在股骨上中1/3處剪斷股骨，剪下一小段與神經(jīng)相連的脊柱（約3個脊椎骨）在膝關(guān)節(jié)下將小腿剪掉，留下的即為坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本。

4、檢查標(biāo)本的興奮性 用經(jīng)任氏溶液潤濕的鋅銅弓輕輕接觸一下坐骨神經(jīng)，如腓腸肌發(fā)生迅速而明顯的收縮，則表明標(biāo)本的興奮性良好，即可將標(biāo)本放在盛有任氏液的培養(yǎng)皿中，以備實驗用。若無鋅銅弓，亦可用中等強度單個電刺激作上述試驗。

（三）試驗過程

1、配置含有不同濃度的維生素C的任氏液8組，在25攝氏度下保溫，濃度分別為0mmol/L（對照組）、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L、、4.0 mmol/L 、5.0 mmol/L 、6.0 mmol/L 、7.0 mmol/L。（其中一組為對照組，七組為預(yù)試驗，待找出適宜范圍后，再分三組進行比較試驗）。

2、隨機選擇規(guī)格相近，色彩鮮艷，健康活潑的牛蛙30只。以上方法制備蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本，分別置于含不同濃度的維生素C的任氏液中浸泡5分鐘待測

3、打開計算機，啟動生物信號采集處理系統(tǒng)，進入“刺激頻率對骨骼肌收縮的影響”模擬實驗菜單，用計算機生物信號采集處理系統(tǒng)進行。以波寬為1ms，從最小刺激強度開始逐漸增加刺激強度對肌肉進行刺激，找到剛剛引起肌肉最大收縮的刺激強度，即為該標(biāo)本的最適刺激強度，整個實驗過程中均固定在此刺激強度上（一般為5～7.5v）。

4、用單刺激作用于坐骨神經(jīng)，可記錄到肌肉的單收縮曲線。用雙刺激作用于坐骨神經(jīng)，使兩次刺激間隔時間為0.06～0.08s，記錄復(fù)合收縮曲線（紙速25～50mm/s）。將刺激方式置于“連續(xù)”，其余參數(shù)固定不變，用頻率為1、6、10、15、20、30Hz的連續(xù)刺激作用于作用于坐骨神經(jīng)，可記錄到單收縮、不完全強直收縮和完全強直收縮曲線（紙速2～10mm/s）。

5、將蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本固定于恒溫容器，跟鏈端連接HU-I型肌肉張力換能器（五號教學(xué)提供），刺激電極置于肌腹上，采用D951生理實驗教學(xué)系統(tǒng)，刺激信號（912ms.7.5v）有4道輸出至刺激電極，給予連續(xù)刺激，肌肉張力信號經(jīng)4道輸入記錄分析系統(tǒng)，連續(xù)記錄單收縮波形（靈敏度0.5，掃描速度32ms/div）至波幅下降至50%為止。

6、分別計算蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌收縮的強度和一個單收縮所需的時間。

（四）統(tǒng)計與分析方法

1、記錄坐骨神經(jīng)腓腸肌的收縮力量、收縮總時間。

2、統(tǒng)計各組的結(jié)果，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，繪制坐骨神經(jīng)腓腸肌收縮張力增量（最大時）的關(guān)系曲線。

3、統(tǒng)計函數(shù)計算并比較，采用單因子方差分析，結(jié)果以±SD表示。

三、結(jié)果與分析

（一）不同濃度對腓腸肌收縮性的影響

本次實驗為預(yù)實驗，先找出蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本收縮的適宜范圍后再行實驗。

此實驗結(jié)果顯示，維生素C對蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的收縮性有相關(guān)性，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增高，收縮性增強；超過一定濃度，收縮性減弱；當(dāng)濃度超過5mmol∕L時，第一次刺激后，坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本發(fā)生了強直收縮。所以確定實驗組的維生素C濃度為0.5mmol∕L、2.0mmol∕L、5.0mmol∕L，并記錄每組實驗數(shù)據(jù)并采用單因子方差分析的方法檢驗實驗數(shù)據(jù)。

與對照組比較P<0.05，P<0.01，0.5mmol/L和 5.0 mmol/L的維生素C都顯著地降低蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的最大收縮幅度，2.0 mmol/L 維生素C作用后，顯著地增加了肌肉最大收縮幅度即：隨著濃度的增加，坐骨神經(jīng)腓腸肌的收縮強度顯示先增加后減小的變化趨勢，且差異顯著（P<0.05）。

經(jīng)比較維生素C濃度為0.5 mmol/ L的任氏液中處理的坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的單收縮時間未有顯著變化（P<0.01），2.0 mmol/L維生素C浸泡后， 極顯著地縮短了蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本的單收縮時間，而5.0 mmol/L 維生素C浸泡后， 顯著性地增加了坐骨神經(jīng)腓腸肌單收縮的時間。

通過以上實驗。腓腸肌在維生素C含量在2.0mmol/L時收縮能力最佳。濃度過高或過低都將會導(dǎo)致肌肉的收縮能力下降。濃度在5.0mmol/L時，肌肉在收縮的初期出現(xiàn)強直收縮，且濃度越高，強直收縮的持續(xù)時間越長。

四、討論

實驗已證實[25]血紅蛋白可使 維生素C 變成促氧化劑。骨骼肌富含肌紅蛋白， 理論上肌紅蛋白也可能使 維生素C 變成促氧化劑。因此， 維生素C對骨骼肌可能有促氧化作用， 會造成肌肉氧化損傷而升高等長收縮的靜息張力，并同時降低等長松弛速度。維生素C 可促進肌肉組織內(nèi)產(chǎn)生超氧陰離子等活性氧， 從而造成肌肉 Ca離子處理系統(tǒng)等成分發(fā)生氧化損傷而降低了肌肉松弛能力[26]。正常條件下， 肌肉組織內(nèi)產(chǎn)生的活性氧量很少，且內(nèi)源性抗氧化能力可有效清除所產(chǎn)生的活性氧， 不會造成肌肉組織明顯的氧化損傷。但等長收縮能力指標(biāo)的變化能更好地表征受到損傷的肌肉成分和控制收縮與松弛的環(huán)節(jié)。維生素C的C–2及C–3兩個相鄰的烯醇式羥基極易解離出H離子是極強的還原劑。細胞外的維生素C與膜內(nèi)維生素E耦聯(lián)起著增強維生素E保護膜脂質(zhì)的作用。肌肉持續(xù)劇烈收縮誘發(fā)大量活性氧的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的活性氧清除劑和具活性氧清除能力的天然產(chǎn)物 ，都可以延緩離體肌肉收縮疲勞。維生素 C是體內(nèi)重要的活性氧清除劑。因此， 本文結(jié)果可能表明適量的維生素C能緩解肌肉疲勞并延緩衰老的可能性，但仍需大量臨床實驗驗證

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