利用肽配體庫分析蛋清中低豐度蛋白質組

劉怡君，邱 寧，馬美湖*

(1．國家蛋品加工技術研發分中心，華中農業大學 食品科技學院，湖北 武漢 430070;2．大連市食品檢驗所，大連市食品藥品監督管理局，遼寧 大連 116630)

蛋清中蛋白質含量是蛋品品質評價的重要指標之一［1－3］。蛋以及蛋制品中的蛋白質研究是提升其價值的重要研究方向，一方面，蛋白質的功效性研究有利于控制蛋品品質;另一方面，具有生物學特性的蛋白質提取與純化有利于增加蛋品的附加值［4］。獲取蛋清中低豐度蛋白質的信息不僅能夠為蛋品品質分級提供參考依據，更可為蛋及蛋制品品質評價提供檢測的分析基礎和信息平臺［5］。蛋清低豐度蛋白質的發現和發展得益于蛋白質組學研究的深入［6－8］，低豐度蛋白質組學是研究蛋白質功能的必然方向，蛋清中低豐度蛋白質的檢測對蛋及蛋制品的品質評價具有重要意義。

蛋清中低豐度蛋白質的研究思路大多與蛋白質組學的研究思路相吻合［9－11］，需要先去除高豐度蛋白質，使蛋清中低豐度蛋白質得到更高效的分離［12－14］。但去除高豐度蛋白質的同時，很多低豐度蛋白質亦被去除。

肽配體庫技術(CPLL)能夠滿足低豐度蛋白質組學研究更高效和更便捷的檢測需求［15－17］。其原理不同于其他低豐度蛋白質研究方法［18－20］，CPLL能夠在不去除高豐度蛋白質的同時將低豐度蛋白質富集，使蛋清蛋白質豐度均衡化［21－24］。這避免了去除高豐度蛋白質同時去除低豐度蛋白質的風險，也使分析過程中容易受高豐度蛋白質影響的低豐度蛋白質得以檢測。

CPLL利用特有的六肽配基，與蛋白質發生特異性吸附，能夠獲得豐度均衡化的蛋白質溶液［17］。這種特異性吸附受益于六肽配體的特殊性質，六肽配體由20種氨基酸鍵連接6個肽配體，大量種類不同的六肽意味著，在理論上，任何蛋白質均能夠得到吸附。實際樣品中，蛋白質與肽配體的相互作用很可能受到靜電作用、離子相互作用、親和相互作用、疏水相互作用等的影響［25］。不同結合方式的蛋白質，解離強度的差異會影響蛋白質的均衡化程度。因此，本文研究了鹽濃度、pH值、洗脫液順序對CPLL豐度均衡化效率的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FE20型pH計、FE30電導率儀(Mettler Toledo，美國);HERAcell 150I恒溫培養箱(Thermo，美國);真空冷凍干燥箱(Hidolph，德國);LTQ－Orbitrap質譜儀(Thermo Electron，德國);Gel－Pro analyzer(Media Cybernetics，美國);PDQuestc_v8.0.1、iMark酶標儀、分光光度計(Bio－Rad，美國)。

ProteoMinerTMCPLL(Bio－Rad，美國);預染色蛋白質(Marker BR Fermentas，美國);胰酶(Promega);丙酮(99%，Promega，美國);裂解液(LB，Bio－Rad，美國);再水化液(99%，Bio－Rad，美國);碘乙酰胺、乙腈(99.9%)、硫代硫酸鈉(99%)、胎牛血清標準品(BSA)、胰酶溶液、鐵氰化鉀(99%)、甲酸(99.9%)、三氟乙酸(TFA，99%)和二硫蘇糖醇(99%)均購自Sigma公司;甲醇(99.9%，Fisher);實驗用水均由Milli-Q純水系統制備。PBS緩沖液:150 mmol/L NaCl，10 mmol/L NaH2PO4(pH 7.4)，尿素CHAPS(3-［3-(膽酰胺丙基)二甲氨基］-1-丙磺酸內鹽):8 mol/L尿素，2%CHAPS，5%乙酸，HOS(有機水溶液):6%乙腈，12%異丙醇，2%氨，80%水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品采集 樣品均來自華中農業大學動物飼養中心。雞蛋品種均為白蘭航，隨機采樣24 h內非受精新鮮雞蛋。隨機取15個新鮮雞蛋，將蛋清與蛋黃分離，收集蛋清于燒杯中，利用磁力攪拌器攪拌直至燒杯中的蛋清完全均勻。為抑制蛋清中的蛋白酶活性，全程操作溫度≤4℃。蛋清均分成3等份，每份100 mL，分別記為A，B，C。A加入PBS固體使蛋清pH值為7.4，含150 mmol/L NaCl;B加入固體鹽粉，使蛋清溶液含有緩沖鹽25 mmol/L KH2PO4，150 mmol/L NaCl，pH 8.8;C為蛋清原液，實測pH 8.8。

1.2.2 CPLL富集 ProteoMinerTM試劑盒(Bio－Rad，美國)。離心柱裝有500 μL珠漿(20%珠粒，20%含水乙醇)。使用PBS緩沖溶液將柱體活化后，分別將蛋清溶液A，B，C與ProteoMinerTM肽配體于20℃室溫振搖2 h，充分富集。富集過程中，蛋清粘蛋白的聚集體在珠球周圍形成白色沉淀，并消除。使用大量的緩沖液以除去過量的可溶性蛋白，使用不同序列的兩個連續的洗脫液:先HOS(C1)，后尿素CHAPS(C2);另一組蛋清溶液先C2后C1洗脫。每個過程重復3次。

1.3 蛋白質組分析

1.3.1 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE) 凝膠樣品通過12.5%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。12.5%分離膠，4%濃縮膠。樣品加熱5 min，180 V恒定電位。凝膠染色，考馬斯藍(Bio－Rad，CA)。對5個差異條帶進行切帶，脫色(脫色液配制:30 mmol/L K3Fe(CN)6－100 mmol/L NaS2O3=1∶1)，脫水，酶切(1.25 mmol/L NH4HCO3稀釋胰酶至12.5 ng/μL)。每管膠粒加入胰酶3 μL，冰浴15 min，加入3 μL 25 mmol/L NH4HCO3，收集液真空濃縮后進行肽段濃縮除鹽，得待測蛋白質溶液。

1.3.2 線性離子阱回旋共振質譜(LTQ)條件 多肽首先經C18反相柱(100 μm i.d．，長10 cm，5 μm)，肽段在反向柱上的洗脫梯度為5%～40%乙腈流動相(A為0.1%甲酸，B為含0.1%甲酸乙腈)洗脫90 min，流速300 nL/min。從反相柱上洗脫的肽段直接用質譜LTQ－Orbitrap檢測:離子傳輸管溫度為200℃;電壓1.9 kV，一級質譜在Orbitrap掃描，掃描范圍350～1 800 Da，分辨率為6 000(m/z 400處)，二級質譜分析在LTQ用CID碰撞模式完成。1個全掃描后選取最強的6個母離子做二級質譜;動態排除如下設置:在30 s內串聯質譜掃描重復2次的母離子，在60 s內不再進行串聯質譜掃描。

數據使用BIWORKS軟件處理轉換為MGF格式文件，通過搜索MASCOAT數據庫鑒定蛋白質。原始文件識別肽段數4 170和P＜0.01肽后驗誤差概率(PEP)和預設的錯誤發現率(FDR)為0.01，實驗重復3次。

2 結果與討論

2.1 鹽濃度對蛋清pH值與電導率的影響

圖1為新鮮蛋清加入PBS緩沖鹽后其pH值與電導率的變化情況，新鮮蛋清蛋白質溶液呈弱堿性環境;隨緩沖鹽含量的升高，蛋清溶液的pH值下降、電導率增加，蛋白質溶液離子間的相互作用增強。

2.2 C1－C2洗脫結果

圖1 緩沖鹽對蛋清pH值和電導率的影響Fig.1 pH values and conductivities corresponding to different salt protein chicken egg white solution buffer:150 mmol/L NaCl with different concentration of NaH2PO4

經過活化的CPLL對A，B，C吸附程度不同(見圖2)。圖2非方框區域，左為標尺(MW)和未經CPLL處理過的蛋清原液(Native);方框區域A為樣品 A經過 CPLL富集，C1連續洗脫兩次(C1E1，C1E2)和C2連續洗脫兩次(C2E1，C2E2)的SDS－PAGE分析結果。方框區域B和C分別為樣品B和樣品C經過CPLL富集后，C1－C2連續洗脫兩次的結果比較。

圖2 C1－C2洗脫順序對A，B，C蛋白溶液豐度均衡化的影響Fig.2 Effect of C1－C2 elution sequence on the A，B and C protein solution abundance equilibrium

從圖2可見，與未經處理的蛋清原液相比，CPLL能夠使蛋清中蛋白質達到豐度均衡化的效果。蛋清蛋白質原液的蛋白質分子量集中在72 kDa(卵轉鐵蛋白)、43 kDa(卵清白蛋白)、15 kDa(卵轉鐵蛋白)。經過CPLL豐度均衡化處理后，A，B，C 3個樣品中其他分子量蛋白質得到了有效富集(見圖2虛線部分)。

通過對比A，B，C 3個樣品發現，鹽濃度不同，其CPLL的富集效率不同。樣品B的富集效率最高。在樣品B鹽濃度的調節下，C1連續兩次洗脫能夠使富集后蛋清蛋白質洗脫相對徹底。

樣品B在C1洗脫完成后，C2洗脫1次可使溶菌酶得到高效分離。這說明，先C1后C2洗脫強度差與溶菌酶在CPLL基質吸附強度差相當。

2.3 C2－C1洗脫結果

在相同活化條件、不同洗脫順序下，樣品A，B，C的CPLL富集效率不同(圖3)。圖3非方框區域，左為標尺(MW)和未經CPLL處理過的蛋清原液(Native);方框區域A為樣品A經過CPLL富集，C2連續洗脫兩次(C2E1，C2E2)和C1連續洗脫兩次(C1E1，C1E2)的SDS－PAGE分析結果。方框區域B和C分別為樣品B和樣品C經過CPLL富集后，C2－C1連續兩次洗脫的結果比較。由圖3可知，C2洗脫液能夠對富集CPLL蛋白質實現高效洗脫。樣品B鹽溶液條件下的洗脫效率比樣品A，C的洗脫效率高。

圖3 C2－C1洗脫順序對A，B，C蛋白溶液豐度均衡化的影響Fig.3 Effect of C2－C1 elution sequence on the A，B and C protein solution abundance equilibrium

2.4 質譜

圖4為蛋清溶液B(pH 8.8的25 mmol/L磷酸鹽緩沖液+150 mmol/L NaCl)，經C2洗脫后的蛋白質分布。由圖4可知，SDSPAGE凝膠電泳條帶的清晰度隨上樣蛋白質凈含量的增大而更顯著。增加蛋清蛋白質的凈含量可提高LTQ質譜檢出率。本研究中取60 μg對應條帶上5個區域的胰蛋白酶經酶切后進行LTQ質譜檢測。根據質譜檢測結果，通過比對雞蛋白質序列數據庫(NCBInr)和接受唯一的親蛋白的鑒定，檢出45個蛋白，結果見表1。

圖4 蛋白質含量對SDS－PAGE灰度的影響Fig.4 Effect of protein content on SDS－PAGE gray scale

根據已有文獻報道，D’Ambrosio等［23］利用CPLL結合表面增強激光解吸電離質譜(SELDI－MS)確定了148個獨特的蛋清中蛋白質種類;Mann等［7］利用數字化線性離子阱質譜(LTQ Orbitrap Velos)先進的計算方法獲得了158個蛋白質的檢測結果。本研究優化了CPLL前處理方法，選取差異條帶進行LTQ質譜檢測，獲得了2種尚未見報道的蛋清蛋白質，分別為229 kDa的蛋白和CCDC42假想蛋白。45種蛋白質的亞細胞位置分析見圖4，其中分泌蛋白和未知蛋白所占比例最大，分別為13個和12個，質膜蛋白7個，其他細胞間蛋白8個，胞外蛋白5個。

表1 45個蛋清蛋白質的質譜鑒定結果Table 1 45 Unique gene products found in egg white by LTQ

(續表1)

由表1可知，卵清蛋白、卵轉鐵蛋白與溶菌酶是蛋清中的高豐度蛋白質。在所選取的差異條帶中，檢測到高豐度蛋白質的可能原因分析如下:①高豐度蛋白質可能與低豐度蛋白質發生相互作用，使高豐度蛋白質與低豐度蛋白質同時被檢測;②降解情況的發生使高豐度蛋白質形成多肽，進行SDSPAGE分析時高豐度蛋白質等電點發生變化，導致其與低豐度蛋白質的條帶重合而被檢測。這種以差異蛋白質條帶為目標的檢測，在某種程度上增大了低豐度蛋白鑒定的可靠性，避免了質譜鑒定過程中因高豐度蛋白質干擾而造成的質譜鑒定靈敏度降低。

2.5 蛋清蛋白質亞細胞定位分析

根據表1中列出的45種蛋白質的質譜信息，通過UniProtKB/Swiss－Prot數據庫檢索，獲得這些蛋白質的亞細胞定位結果(圖5)。45種蛋白質中有19種蛋白質與雞胚發育關系密切，可能參與某些生物活動并發揮功能。此外，其中一些蛋白質的亞細胞定位不是蛋清，差異條帶中檢測到的蛋白質，分泌型蛋白質相對較多。據推測，這些蛋白質在蛋清中出現很可能是源于雞胚形成過程輸卵管壁等遺留蛋白。同時有部分是細胞器中的蛋白質，未知亞細胞位置的蛋白質占較大比重。

圖5 蛋清蛋白亞細胞定位(描述來源UniProtKB/Swiss－Prot數據庫)Fig.5 Subcellular location of proteins identified in egg white corresponding to Table 1 by description and origin of the protein in UniProtKB/Swiss－Prot

3 結論

蛋清中低豐度蛋白質豐富，利用肽配體庫技術可高效、快速地分析蛋清中的低豐度蛋白質組。先HOS后尿素CHAPS連續洗脫能夠獲得高純度溶菌酶，該洗脫方式擴大了肽配體庫的使用范圍。提高CPLL對低豐度蛋白質的吸附和洗脫效率的最優條件為:pH 8.8，25 mmol/L磷酸鹽緩沖液，150 mmol/L NaCl。實驗結果表明:通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，線性離子阱質譜檢測的分析方法，能夠使蛋清中低豐度蛋白質的檢測達到亞細胞水平。

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