TD70/Kasalath RⅠL群體定位水稻花藥基部開裂長度QTL

趙 凌， 張亞東， 趙春芳， 周麗慧， 姚 姝， 于 新， 丁 丹， Tsutomu Matsui，王才林

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京210014;2.Faculty of Applied Biological Science，Gifu University，Gifu 501-2354，Japan)

近年來，隨著全球氣候的變化，高溫?zé)岷︻l頻發(fā)生，給中國乃至全世界的水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失，尤其在孕穗期和開花期遇到高溫?zé)岷斐煞浅?yán)重的危害。開展高溫耐性研究，對于培育開花期耐高溫的水稻品種，降低高溫危害具有非常重要的意義。高溫耐性屬于數(shù)量性狀，運(yùn)用直接鑒定法和間接鑒定法對于育種者而言實施都較為困難。直接鑒定法利用自然高溫條件在田間進(jìn)行，簡單易行，但限制因子較多，難以排除其他環(huán)境因子的影響，重復(fù)性較差。間接鑒定法一般利用溫室和人工氣候箱模擬自然高溫條件進(jìn)行鑒定，在控制溫度和光照的情況下進(jìn)行高溫耐性鑒定，準(zhǔn)確性較高，但需要昂貴的儀器，一次鑒定規(guī)模有限。不管是直接鑒定還是間接鑒定，對高溫鑒定指標(biāo)的選擇都非常重要。研究者提出了不少用于鑒定水稻開花期耐高溫的指標(biāo)，最常用的為高溫條件下的結(jié)實率［1］。由于高溫條件下的結(jié)實率鑒定比較困難，研究者也提出了其他一些耐熱性指標(biāo)，如結(jié)實率的脅迫指數(shù);秕粒率、實粒質(zhì)量、整精米率、堊白度、蛋白質(zhì)含量的脅迫指數(shù)［2］;高溫條件下葉綠素、游離脯氨酸、脫落酸含量及花粉活力［3］等。運(yùn)用不同的耐熱性指標(biāo)鑒定到很多水稻耐熱QTL位點［4-11］，但這些鑒定指標(biāo)在育種中直接應(yīng)用還具有一定難度。找到與開花期高溫耐性密切相關(guān)且容易在常溫下鑒定的指標(biāo)對于水稻耐高溫育種迫在眉睫。

Matsui等進(jìn)行了水稻花藥基部開裂長度(Length dehiscence at the basal part of thecae，LDBT)和高溫耐性的相關(guān)研究，明確開花期高溫耐性與花藥基部開裂程度有關(guān)［12-13］，花藥基部開裂性狀見圖1，長的花藥基部開裂是高溫條件下保證結(jié)實率的有利性狀，不僅年度間穩(wěn)定，且在高溫和常溫條件下的表達(dá)具有平行性，提出可以在常溫下利用水稻花藥基部開裂長度進(jìn)行開花期高溫耐性鑒定［14-17］。Zhao以高溫結(jié)實率作為水稻高溫育性指標(biāo)，也發(fā)現(xiàn)3個可能與水稻高溫育性有關(guān)的性狀(花藥基部開裂長度、開花時間、穗部溫度)中高溫結(jié)實率與開花時間以及穗部溫度間并沒有相關(guān)性，而與花藥開裂長度呈顯著正相關(guān)［18］。Jagadish的研究結(jié)果也證實水稻開花期高溫耐性與花藥基部開裂程度有關(guān)［6］。

本研究利用親本花藥基部開裂長度存在顯著差異的重組自交系群體(RIL)為作圖群體，進(jìn)行花藥基部開裂長度的QTL定位和分析，進(jìn)一步研究水稻花藥基部開裂性狀和其他農(nóng)藝性狀的相關(guān)性，為開花期耐熱性研究提供理論依據(jù)。

圖1 花藥頂部和基部開裂［12］Fig.1 A dehisced anther

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以1個來源于天鵝谷///9520//(72-496/蘇御糯)的粳稻品系TD70和秈稻品種Kasalath為親本配制組合。2005年夏從F1單株收獲自交種子，以單粒傳方法構(gòu)建成由240個株系組成的重組自交系(RIL)群體。于2012年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗田種植240個F2:7RIL群體及其親本。所有材料秧齡30 d，每個株系種植1個小區(qū)，每小區(qū)4行，每行10株，行株距為26.7 cm×16.7 cm，單本栽插。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，2次重復(fù)。田間管理按常規(guī)栽培管理方法。成熟后，每小區(qū)在中間行隨機(jī)選擇5個單株，按單株分別收獲。

1.2 溫度測定

用溫濕監(jiān)測儀(型號:HOBO U23-001)記錄水稻冠層的最高溫度，從0∶00開始，每1 h記錄1次，每1 d 24 h監(jiān)測。

1.3 性狀測定

花藥基部開裂長度:測量240個株系及其親本的平均花藥基部開裂長度。每份材料隨機(jī)調(diào)查5個代表性植株，各性狀的均值作為性狀表型值進(jìn)行分析。使用數(shù)字顯微鏡(VHX-500，Keyence Corportion，Osaka)直接測量花藥基部開裂長度，每個小花隨機(jī)測量5個花藥。取5個花藥的平均值作為小花的LDBT值，取5個小花的平均值作為單株的LDBT值。成熟后每小區(qū)在中間行隨機(jī)選擇5個單株，按單株分別收獲。

抽穗期:整個小區(qū)50%單株抽穗的一天為抽穗當(dāng)天，計算相關(guān)系數(shù)時將抽穗期表示為從播種到抽穗當(dāng)天的天數(shù)。抽穗期間指抽穗當(dāng)天及其前后各3 d。

農(nóng)藝性狀測定:性狀包括240個株系及其親本的株高、分蘗數(shù)、劍葉長、劍葉寬、結(jié)實率、總粒數(shù)、千粒質(zhì)量、粒寬、粒厚、芒長等，取5個單株的平均值作為性狀表型值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計分析

TD70與Kasalath的重組自交系群體的分子連鎖圖譜包含141個分子標(biāo)記［19］，利用QTL IciMapping Version3.4軟件［20］，采用完備區(qū)間作圖法(Inclusive composite interval mapping，ICIM)在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，檢測控制花藥基部開裂長度的QTL。以LOD值2.5作為閾值，判斷QTL的存在，QTL的命名參照McCouch等［21］的原則。

使用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體及其親本的花藥基部開裂長度的表型變異

2012年RIL群體及其親本的花藥基部開裂長度的表型變異見表1。親本TD70花藥基部開裂長度平均值為590.1 μm，而Kasalath的花藥基部開裂長度平均值為342.4 μm。兩親本在花藥基部開裂長度上存在極顯著差異。從RIL群體的變異范圍來看，重復(fù)1變幅為 247.6～864.4 μm，均值為446.4 μm，變異系數(shù) 81.43%;重復(fù) 2變幅為 254.9～781.9 μm，均值 448.2 μm，變異系數(shù) 79.49%(表1)。群體2個重復(fù)間差異不顯著。

群體中花藥基部開裂長度存在明顯的超親現(xiàn)象。從TD70/Kasalath RIL群體的頻率分布看，花藥基部開裂長度呈連續(xù)性并為正態(tài)分布，表現(xiàn)出數(shù)量性狀的遺傳特點(圖2)。

表1 親本與重組自交系群體花藥基部開裂長度的表型變異Table 1 Phenotypic variation of LDBT of rice RⅠL population and two parents

圖2 RⅠL群體的花藥基部開裂長度性狀的分布Fig.2 Distribution of rice LDBT among rice RⅠL population

2.2 花藥基部開裂長度的QTL檢測

對RIL群體進(jìn)行花藥基部開裂長度的QTL檢測，共檢測到2個QTL位點，分別分布在第6和第8染色體上(圖3)。qLDBT6位于第6染色體RM3和RM3628之間15.8cM的區(qū)間內(nèi)，LOD值3.23，貢獻(xiàn)率為6.18%，加性效應(yīng)為17.74%;qLDBT8位于第8染色體RM1376和RM4085之間11.1 cM的區(qū)間內(nèi)，LOD值2.95，貢獻(xiàn)率8.00%，加性效應(yīng)20.09%。2個QTL位點的增效等位基因都來源于母本TD70(表2)。

2.3 RIL群體孕穗后期和開花期間的溫度

親本TD70和Kasalath的抽穗期分別為8月11日和8月9日。RIL群體的抽穗期分布從7月25日到9月9日。2012年7月22日至9月12日的日最高溫度和日平均溫度的變化如圖4。其中日平均溫度和日最高溫度最高值均出現(xiàn)在7月30日，分別為32.34℃和37.18℃;9月9日的日平均溫度和日最高溫度均最低，分別為20.39℃和21.08℃。2012年7月19日至9月12日間只有14 d日平均溫度超過30℃，其中3 d日平均溫度超過32℃，只有1 d日最高溫度超過37℃。

圖3 檢測到的花藥基部開裂長度QTL在染色體上的位置Fig.3 The QTL loci for LDBT on rice chromosome

表2 在RⅠL群體中檢測到的花藥基部開裂長度的QTLTable 2 Ⅰdentification of QTLs for LDBT in rice RⅠL population

圖4 RⅠL群體抽穗期間的溫度Fig.4 Temperatures during heading in rice RⅠLs

2.4 花藥基部開裂長度和其他農(nóng)藝性狀的相關(guān)性

從表3可以看出，RIL群體的花藥基部開裂長度與劍葉寬、千粒質(zhì)量、粒長、粒寬、粒厚間存在極顯著正相關(guān)，與抽穗期、株高、分蘗數(shù)、劍葉長、總粒數(shù)、結(jié)實率、抽穗期當(dāng)天最高溫度、抽穗期平均溫度和抽穗期間最高溫度以及芒長之間不相關(guān)。

3 討論

高溫脅迫已成為影響水稻生產(chǎn)的主要因素之一，開展水稻耐高溫的相關(guān)研究具有重要意義。前人研究結(jié)果表明水稻花藥基部開裂長度與開花期高溫耐性有關(guān)，并設(shè)想將水稻花藥基部開裂長度作為常溫下進(jìn)行開花期高溫耐性鑒定的指標(biāo)。進(jìn)行水稻花藥基部開裂長度的相關(guān)研究，可以為此設(shè)想提供更多的理論依據(jù)。

表3 花藥基部開裂長度和其他農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性分析Table 3 The correlation analyses between LDBT and agronomic traits

本研究中定位到的控制水稻花藥基部開裂長度的qLDBT8，位于第8染色體RM1376和RM4085之間11.1 cM的區(qū)間內(nèi)。據(jù)Graneme網(wǎng)站截至2014年1月的不完全統(tǒng)計，目前所有發(fā)掘出的水稻QTL中涉及此區(qū)間的僅有4個位點(圖5)。其中He等利用Peiai 64S/8902S的F2群體的240個株系檢測到1個控制不育的位點S8也位于此區(qū)域［22］。S8位于第8染色體RM885和RG333之間0.57 Mb的區(qū)間內(nèi)，在自然長日照處理、自然短日照處理、人工氣候室長日照高溫處理、人工氣候室長日照低溫處理和人工氣候室短日照高溫處理條件下都可以檢測到，是一個穩(wěn)定的控制育性QTL［23］。由于前人研究結(jié)果表明花藥基部開裂長度也是同高溫育性相關(guān)的性狀，推測我們定位到的qLDBT8區(qū)域與小穗不育有重要關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。

控制水稻抽穗期的主效位點Ghd8也位于第8染色體 qLDBT8所在的區(qū)域內(nèi)，物理距離4 331 109～4 333 832 bp，編碼轉(zhuǎn)錄因子CCAAT盒結(jié)合蛋白的HAP3H亞基［24］。Ghd8不僅調(diào)節(jié)抽穗期，還同時具有調(diào)控水稻產(chǎn)量和株高的功能，和Hd5等位［25-26］。此外，qLDBT8所在的區(qū)域內(nèi)還具有一個水稻生物產(chǎn)量QTL(qpw)和一個水稻稻瘟病抗性QTL(rbr8)［27-28］，這 2 個 QTL 在同一個位置，都位于RG333～RM25間2.7 Mb的區(qū)間內(nèi)。

圖5 qLDBT8區(qū)間內(nèi)定位到的QTLFig.5 QTLs identified in the interval of RM1376 and RM4085 on chromosome 8

前期研究結(jié)果表明，水稻花藥基部開裂長度是和高溫下結(jié)實率相關(guān)的性狀。國內(nèi)外對水稻花藥基部開裂長度的研究主要集中在和高溫耐性的相關(guān)性研究。本研究首次對水稻花藥基部開裂性狀和農(nóng)藝性狀的相關(guān)性進(jìn)行了分析。TD70是一個特大粒型的粳稻資源，其千粒質(zhì)量達(dá)70 g，不僅粒長和粒寬比較大，其花藥基部開裂長度也非常大，是一個進(jìn)行花藥基部開裂長度研究的非常好的材料。本研究檢測發(fā)現(xiàn)RIL群體中花藥基部開裂長度和結(jié)實率并不相關(guān)，這可能和2012年夏天抽穗期間的溫度有關(guān)。石春林等以華粳1號和特優(yōu)559為材料，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂期33℃以下的溫度對供試材料結(jié)實率無明顯影響［29］。時寬玉等分析中稻花期高溫的變化及其對產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明當(dāng)極端高溫處于35～39℃時中稻的平均產(chǎn)量與35℃以下時中稻的平均產(chǎn)量無顯著差異;當(dāng)極端高溫達(dá)39℃以上時，平均產(chǎn)量會顯著降低13%［30］。王才林等則發(fā)現(xiàn)開花期日平均氣溫32℃以上，高溫就會對水稻開花授粉造成影響［31］。2012年夏天7月25日到9月9日期間，日平均溫度超過32℃只有3 d，只有1 d(7月30日)日最高溫度超過37℃。而本研究240個RIL家系中，有16個家系的抽穗期在8月5號之前，8月6號后并沒有出現(xiàn)日最高溫度37℃以上的高溫天氣。開花期溫度不夠高可能是本研究RIL群體花藥基部開裂長度和結(jié)實率不相關(guān)的原因。

［1］ 楊永杰，符冠富，熊 杰，等.高溫對水稻的影響及水稻耐熱性測評方法研究［J］.中國稻米，2012，18(1):39-40.

［2］ 黃英金，楊芝燕，饒志明，等.灌漿期高溫脅迫下水稻葉片葉綠素降解的活性氧損傷及調(diào)控研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，22(5):1-6.

［3］ 雷東陽，陳立云，李穩(wěn)香，等.高溫對不同雜交稻開花期影響的生理差異［J］.農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，2005，26(5):397-400.

［4］ 楊梯豐，張少紅，王曉飛，等.水稻抽穗開花期耐熱種質(zhì)資源的篩選鑒定［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，33(4):585-589.

［5］ ZAHNG G L，CHEN L Y，XIAO G Y，et al.Bulked segregant analysis to detect QTL related to heat tolerance in rice(Oryza sativa L.)using ssr markers［J］.Agricultural Sciences in China，2009，8(4):482-487.

［6］ JAGADISH S，CAIRNS J，LAFITTE R，et al.Genetic analysis of heat tolerance at anthesis in rice ［J］.Crop Scicnce，2010，50:1633-1641.

［7］ 盤 毅，羅麗華，鄧化冰，等.水稻開花期高溫脅迫下的花粉育性 QTL定位［J］.中國水稻科學(xué)，2011，25(1):99-102.

［8］ XIAO Y H，PAN Y，LUO L.Quantitative trait loci associated with seed set under high temperature stress at the flowering stage in rice［J］.Euphytica，2011，178:331-338.

［9］ YE C R，ARGAYOSO M A，REDONA E D，et al.Mapping QTL for heat tolerance at flowering stage in rice using SNP markers［J］.Plant Breeding，2012，131:33-41.

［10］ CHENG L，WANG J M，VERONICA U，et al.Genetic analysis of cold anthesis in rice tolerance at seedling stage and heat tolerance at anthesis in rice(Oryza sativa L.) ［J］.Journal of Intergrative Agriculture，2012，1(3):359-367.

［11］ LEI D Y，TAN L B，LIU F X，et al.Identification of heat-sensitive QTL derived from common wild rice(Oryza rufipogon Griff.)［J］.Plant Science，2013，201-202:121-127.

［12］ MATSUI T，OMASA K，HORIE T.High temperature at flowering inhibits swelling of pollen grains，a driving force for thecae dehiscence in rice(Oryza sativa L.) ［J］.Plant Production Science，2000，3:430-434.

［13］ MATSUI T，KOBAZSAI K，KAGATA H，et al.Correlation between viability of pollination and length of basal dehiscence of the theca in rice under a hot and humid condition［J］.Plant Production Science，2005，8(2):109-114.

［14］ MATSUI T.Function of long basal dehiscence of the thecae in rice(Oryza sativa L.)pollination under hot and humid condition［J］.Phyton，2005，45:401-407.

［15］ MATSUI T，OMASA K，HORIE T.The difference in sterility due to high temperature during the flowering period among japonicarice varieties［J］.Plant Production Science，2001，4:90-93.

［16］ TIAN X，MATSUI T，LI S，et al.Heat induced floret sterility of hybrid rice(Oryza sativa L.)cultivars under humid and low wind conditions in the field of Jianghan Basin，China［J］.Plant Prodoction Science，2010，13:243-251.

［17］黃 鷂，王 建，戴偉民，等.復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因水稻B2A68在南京地區(qū)雜草化的風(fēng)險評估［J］.雜草科學(xué)，2014，32(1):60-68.

［18］ ZHAO L，KOBAYASI K，HASEGAWA T，et al.Traits responsible for variation in pollination and seed set among six rice cultivars grown in a miniature paddy field with free air at a hot，humid spot in China［J］.Agriculture，Ecosystems and Environment，2010，139:110-115.

［19］董少玲，張穎慧，張亞東，等.水稻重組自交系分子遺傳圖譜構(gòu)建及分蘗角的 QTL檢測［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28(2):236-242.

［20］王建康.數(shù)量性狀基因的完備區(qū)間作圖方法［J］.作物學(xué)報，2009，35(2):239-245.

［21］ MCCOUCH S R，CHO Y G，YANO M，et al.Report on QTL nomenclature［J］.Rice Genet Newsl，1997，14:11-13.

［22］ HE Y Q，YANG J，XU C G，et al.Genetic bases of instability of male sterility and fertility reversibility in photoperiod-sensitive genic male-sterile rice［J］.Theoretical and Applied Genetics，1999，99:683-693.

［23］ WEI X J，XU J F，GUO H N，et al.DTH8 suppresses flowering in rice，influencing plant height and yield potential simultaneously［J］.Plant Physiology，2010，153(4):1747-1758.

［24］ YAN W H，WANG P，CHEN H X，et al.A major QTL，Ghd8，plays pleiotropic roles in regulating grain productivity，plant height，and heading date in rice ［J］.Molecular Plant，2011，4(2):319-330.

［25］ DAI X D，DING Y N，TAN L B，et al.LHD1，an allele of DTH8/Ghd8，controls late heading date in common wild rice(Oryza rufipogon) ［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2012，54(10):790-799.

［26］ SHIBAYA T，NONOUE Y，ONO N，et al.Genetic interactions involved in the inhibition of heading by heading date QTL，Hd2 in rice under long-day conditions［J］.Theoretical and Applied Genetics，2011，123:1133-1143.

［27］ LIAN X，XING Y，YAN H，et al.QTLs for low nitrogen tolerance at seedling stage identified using a recombinant inbred line population derived from an elite rice hybrid［J］.Theoretical and Applied Genetics，2005，112:85-96.

［28］ CHEN H，WANG S，XING Y，et al.Comparative analyses of genomic locations and race specificities of loci for quantitative resistance to Pyricularia grisea in rice and barley［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100(5):2544-2549.

［29］石春林，金之慶，鄭建初，等.減數(shù)分裂期高溫對水稻穎花結(jié)實率影響的定量分析［J］.作物學(xué)報，2008，34(4):627-631.

［30］時寬玉，崔永偉，胡瑞法.水稻花期高溫對產(chǎn)量的影響研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2009(2):78-83.

［31］王才林，仲維功.高溫對水稻結(jié)實率的影響及其防御對策［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004(1):15-18.