運用農桿菌介導的針刺法將外源基因轉入水稻

顏文飛， 張啟軍， 秦海龍， 廖慧敏， 宗壽余， 夏士健， 呂川根

(1.南京農業大學農學院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農業科學院糧食作物研究所/江蘇省優質水稻工程技術研究中心，江蘇 南京210014)

轉基因技術作為一種可持續發展方式，可提高農作物產量、品質和抗性等，具有良好的發展前景，將為農業發展注入新的動力［1］。目前，在水稻育種上相繼開發研究的轉基因技術有以農桿菌為主導的載體介導轉基因技術，以基因槍、PEG等介導的基因直接導入技術和以花粉管通道轉化、生殖細胞浸泡吸收為主的種質系統轉化技術，其中農桿菌介導技術約占 64%［2］。

農桿菌細胞內的Ti質粒或Ri質粒具有一段T-DNA，可通過農桿菌侵染植物傷口進入細胞，并插入到植物基因組中。通過將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，借助農桿菌的感染，可實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株［3］。自從1978年 Chilton等［4］第1次利用農桿菌的Ti質粒為載體將T-DNA上的胭脂堿基因轉入煙草細胞以來，農桿菌介導法在雙子葉植物轉化中得到了廣泛應用。1986年，Baba等［5］通過PEG法將農桿菌原生質球與水稻原生質體融合，獲得了能合成胭脂堿的水稻轉化組織。之后，科學界開始對農桿菌介導的水稻轉化技術進行廣泛的研究，試圖通過轉基因技術提高水稻產量、改良品質和增強抗性［6-8］。但是，由于國內外不同實驗室使用的基因型、受體植體的不同和培養條件的差異，各個轉化體系得到的結果不盡相同，轉化率也普遍不高。所以，研究人員分別從Ti質粒的改造、轉化載體的構建和組織培養等方面入手，不斷優化農桿菌介導的水稻轉化方法，以期提高轉化效率。

經過近20多年的發展和優化，農桿菌介導轉基因技術的轉化效率得到了長足的提高，但與現代農業對轉基因產品的需求相比，其步伐仍然不夠快，仍存在許多障礙和安全隱患，需進一步加強轉化技術的研發，突破核心技術。

利用植物生長點轉化的原理是外源DNA通過細胞間隙進入莖尖生長點細胞部位，并轉化生長點細胞，從而產生轉基因后代。近年來，已有一些關于植物生長點用于轉化的報道，主要是在小麥、玉米上。1996年，杜立群等［9］用小麥的生長點作為外源基因的直接受體，利用基因槍轟擊獲得轉基因小麥。2005年，Razzaq等［10］以小麥為材料，嘗試了一種對生長點直接進行轉化的方法，并初步證明了這一方法的可行性。2009年，董福雙等［11］以小麥品種石4185為對象，建立了受體制備方法，初步建立了基因槍法轉化小麥種子芽生長點的技術。2011年，孫傳波等［12］以玉米自交系鄭58的莖尖為受體，通過農桿菌介導法將抗草甘膦EPSPS基因轉入玉米，初步證明外源基因已經整合到玉米基因組中，以玉米莖尖作為受體的轉化系統可行、高效。在水稻上，2001年，林擁軍利用農桿菌浸種法將反義Wx基因導入水稻品種珍汕 97B［13］。2005 年，Putu 等［14］利用農桿菌介導直接侵染粳稻品種越光胚芽生長點也獲得轉基因植株。

本研究將沾有外源基因的農桿菌菌液的接種針直接刺破侵染受體水稻的胚芽生長點，完成轉基因操作，而不需誘導愈傷組織以及之后的一系列組織培養過程，為轉化水稻提供一種簡單、快速、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 受體水稻品種 水稻(Oryza sativa L.)品種南粳45由江蘇省農業科學院糧食作物研究所仲維功研究員提供。南粳45于2009年通過江蘇省品種審定委員會審定，為江蘇省主栽品種，并被農業部列為超級稻推廣品種。

1.1.2 載體和菌株 農桿菌菌株LBA4404含轉化質粒pBI121-GUS，含GUS基因(圖1)，由南京曉莊學院蔡小寧教授饋贈。

圖1 質粒PBⅠ121-GUS結構示意圖Fig.1 Structure diagram of plasmid PBⅠ121-GUS

1.1.3 試劑 BU-Taq酶、dNTP、Taq Buffer、質粒提取試劑盒均購自南京天為生物科技有限公司，DNA分子量標準購自天根生化科技(北京)有限公司。卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、頭孢霉素(Cef)、乙酰丁香酮(As)為Simga公司產品。X-Gluc、DMF為Biosharp公司產品。其他試劑均為國產分析純。引物(表1)由上海英駿公司合成。

1.1.4 培養基 LB培養基(用于培養農桿菌):酵母提取物5 g/L，胰化蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0(固體培養基+瓊脂15 g/L)。

表1 基因位點或連鎖標記的引物序列Table 1 Primer sequence of gene or linkage markers

1.2 方法

1.2.1 水稻胚生長的觀察 將南粳45種子浸沒在含清水的培養皿里，在24℃下培養。每天分別挑取3～4粒種子，用解剖刀解剖后，在顯微鏡下觀察胚的形態和結構，確定胚芽生長點的大體位置，共觀察14 d。

1.2.2 植物表達載體農桿菌的培養與檢測

1.2.2.1 植物表達載體農桿菌的培養 取農桿菌LBA4404菌液(帶有轉化質粒pBI121-GUS)200 μl于1.5 ml離心管中，用接種環進行平板劃線(Kan，50 μg/ml;Rif，50 μg/ml)，28 ℃倒置培養 48 h，挑選單菌落接種于10 ml的LB液體培養基中(含50 mg/L Rif和50 mg/L Kan)，28 ℃，200 r/min振蕩培養24 h。

取培養好的檢測有陽性質粒的上述菌液1 ml，放至100 ml液體LB培養基(含100 μmol/L As)中擴大培養，28℃ 200 r/min振蕩培養至OD600為0.3。為了便于觀察和使農桿菌生長狀態良好，擴大培養液里不加抗生素。

1.2.2.2 植物表達載體農桿菌陰陽性的檢測 按照Biomiga Ezgene公司生產的Plasmid Miniprep Kit試劑盒的使用說明書進行質粒DNA的微量提取。PCR 擴增體系:10× PCR buffer 2.0 μl，dNTP(2 mmol/L)2.0 μl，Primer(2 mmol/L)2 μl，Taq DNA聚合酶 1 U，質粒 DNA 2.0 μl，補充超純水至 20 μl。

PCR擴增程序為:94℃、5 min;94℃、30 s，57℃、30 s，72 ℃、50 s，35 個循環;72 ℃、10 min。擴增產物加指示劑后用1%的瓊脂糖凝膠進行1 h的110 V電泳后照相。選取PCR擴增結果為陽性的菌液進行擴大培養。

1.2.3 水稻的遺傳轉化 以下操作均需在無菌條件下進行。

1.2.3.1 水稻種子的培養 將未去穎殼的南粳45種子先用75%的乙醇浸泡5 min，再用0.1%的升汞殺菌15～20 min，無菌水沖洗 3～4次。用無菌鑷子將消毒后的種子放在鋪有1層濾紙、盛有10 ml無菌水的培養皿中，每皿15粒，26～28℃培養1～2 d，直至種子微露白。

1.2.3.2 農桿菌侵染水稻種胚 用沾有擴大培養后的農桿菌菌液的接種針刺入水稻種胚，然后將種子放入植物培養瓶中(內有2 cm厚的蛭石，蛭石上鋪有1張濕潤的濾紙)，每瓶15粒，22～24℃暗培養9～14 d，共侵染90粒。

1.2.3.3 水稻轉化苗的殺菌與移苗 將暗培養后苗長為10 cm左右的轉化苗浸泡在濃度為1 mg/ml的Cef溶液中1 h，之后，將苗移栽到網室中的盆缽中，盆缽直徑30 cm，每盆5苗。

1.2.4 轉基因苗的DNA檢測 待處理后的苗長至7～8葉、株高40 cm以上時，每株取200 mg左右嫩葉進行DNA檢測，以正常南粳45秧苗為陰性對照。用SDS法從水稻新鮮葉片中微量提取總DNA。以正常南粳45秧苗為陰性對照，上述質粒DNA檢測為陽性的質粒DNA為陽性對照，以水稻基因組DNA為模板，以GUS基因的序列設計引物進行轉基因植株的PCR分析。

PCR 擴增體系:10 × PCR buffer 2.0 μl，dNTP(2 mmol/L)2.0 μl，Primer(2 mmol/L)2.0 μl，Taq DNA 聚合酶1 U，DNA 2.0 μl，補充超純水至20 μl。PCR 擴增程序為:94 ℃、5 min;94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、54 s，35個循環;72℃、10 min。擴增產物加指示劑后用1%的瓊脂糖凝膠進行1 h的110 V電泳后照相。

1.2.5 轉基因苗GUS基因的組織化學檢測 對上述DNA檢測有GUS基因的水稻，每株取2張葉片，并取2張陰性對照水稻葉片，先用90%丙酮在-20℃浸泡至少2 h。將丙酮浸泡后的水稻葉片用無菌水沖洗后轉到已過濾除菌的X-Gluc染色液中，37℃水浴10 h。水浴后棄染色液，轉入 70%～100%乙醇中脫色2～3次，至陰性對照材料呈白色(室溫下)。肉眼或顯微鏡下觀察，具有GUS活性的部位或位點是否呈現藍色或藍色斑點。

1.2.6 T1代轉基因苗的培育和基因檢測 對T0代檢測有GUS基因的水稻苗，待其成熟后單株收獲種子，編號，包在扎有透氣孔的種子袋里，45℃下烘2 d。2 d后將種子拿出，待其溫度退到室溫時，隨機選取8個種子袋，將其泡在0.5%的升汞溶液中浸種24 h，然后經清水沖洗，包在濕布里放在白熾燈管上催芽至露白，期間勤加水，保持布處于濕潤狀態。將催芽后的種子按編號播種在網室里，蓋上保溫膜，30 d后分群體取樣，進行DNA檢測和GUS組織化學檢測(方法同方法1.2.4和方法1.2.5)。

2 結果與分析

2.1 水稻胚的生長

經過14 d的反復觀察，水稻胚的生長動態及胚芽胚根露出種孔后的大致位置如圖2e:胚根位于種孔的中上部，胚芽位于種孔的中下部，二者生長后期呈45°～180°，這使我們明確了進行下一步侵染轉化時針刺生長點的大致位置。

圖2a:胚尚未露出種孔，胚的形態結構尚未清晰;圖2b:胚已微露出種孔，胚芽胚根已可區分;圖2c:胚微露出種孔，胚芽胚根形態結構分明;圖2d:胚已幾乎全露出種孔，胚芽胚根形態結構分明，胚芽胚根分化明顯。由此我們確定，在水稻浸泡24～36 h，胚芽胚根已可區分但尚未完全分化時，進行轉基因的針刺侵染最為合適。

圖2 水稻胚的生長Fig.2 Growth of rice embryo

2.2 侵染轉化后的秧苗生長

侵染轉化后的秧苗生長見圖3，待轉化苗長至10 cm左右，用Cef溶液進行殺菌消毒后轉至網室盆栽。其中侵染了90粒南粳45種子，成苗48株，成苗率達53.3%。

2.3 轉基因T0代的PCR檢測

對48棵T0代轉化植株進行PCR檢測，凝膠電泳顯像結果中，由于有些DNA擴增條帶較模糊，本試驗把它們歸為陰性植株。保守確定，PCR檢測中有16棵植株擴增條帶為陽性(圖4)，轉化率達33.3%，初步證實GUS基因已導入水稻基因組中。

2.4 轉基因T0代GUS基因的組織化學檢測

取未針刺轉化的南粳45葉片2張作陰性對照(CK)，對于上述DNA檢測為陽性的水稻，每個單株取2張葉片，共34張葉片，進行GUS基因的組織化學檢測。經酒精脫色后對照呈白化顏色，而32張轉GUS陽性T0代葉片均有不同程度的藍色斑點顯現(圖5)，再次驗證了GUS基因已導入南粳45基因組中，并在蛋白質水平上表達。

圖3 侵染轉化后水稻苗的生長Fig.3 Growth of rice after genetic transformation

圖4 轉基因T0代植株的PCR檢測Fig.4 PCR assays of T0transgenic plants

圖5 部分轉基因T0代植株GUS基因的組織化學檢測Fig.5 Histochemical assay of GUS gene in some T0transgenic plants

2.5 轉基因T1代的PCR檢測

對8個T1代轉基因群體進行PCR檢測，發現其中4個T1代群體中99%植株可檢測到GUS基因，其群體植株總數分別為32株、37株、46株和15株。而其余4個T1代群體(植株總數分別為24株、64株、52株和66株)中，只有部分植株檢測到GUS基因，呈分離現象，陽性植株與陰性植株的分離比依次為 1.0∶3.0、1.0∶1.5、1.0∶2.4、1.0∶10.0。說明 GUS基因已從 T0代傳遞到T1代，但后代分離并不符合孟德爾遺傳分離比例。

2.6 轉基因T1代GUS基因的組織化學檢測

對種植的8個T1代群體均隨機在4株苗上各取1張葉片，陰性對照葉片2張，共34張葉片，進行GUS基因的組織化學染色檢測。結果如圖6，對照CK經酒精脫色后呈白化顏色，而轉GUS陽性T1代苗經酒精脫色后均顯藍色。進一步說明T1代植株中存在GUS基因，且已在蛋白質水平上表達。

圖6 部分轉基因T1代植株GUS基因的組織化學檢測Fig.6 Histochemical assay of GUS gene in some T1transgenic plants

3 討論

本方法中南粳45 T0代轉化率保守達33.3%，即在生長成植株的48株中，16株經PCR檢測和GUS基因的組織化學染色檢測均為陽性，說明外源基因不僅導入水稻基因組中，且已在蛋白質水平上表達。利用愈傷進行遺傳轉化的轉化率表示的是基因檢測為陽性的抗性植株/進行共培養的愈傷總數。據不完全調查，近年來，對植株轉化成功率進行統計的結果有:1994年，Hiei等［15］實現對粳稻的高頻轉化，轉化率達到28.6%;2003年，殷麗青等［16］以15個秈稻、粳稻栽培品種為材料，粳稻遺傳轉化頻率為3.9%～11.4%，秈稻遺傳轉化頻率為 0.2%～8.1%;2005年，劉元鳳等［17］對4個秈稻品種進行遺傳轉化，平均穩定轉化率為23.6%;2005年，任永霞等［18］對植物遺傳轉化方法進行概述，統計出利用農桿菌轉化粳稻和秈稻的遺傳轉化率分別為29.0%和22.0%;2007年，胡麗華等［19］利用農桿菌介導法將檸檬酸合成酶基因導入秈稻明恢86，獲得抗性植株轉化率為6.0%;2007年，寧約瑟等［7］在對農桿菌介導水稻遺傳轉化研究進展中提到秈稻轉化較困難，多數秈稻轉化率不超過10.0%;2008年，劉永巍等［20］以粳稻品種空育131、墾鑒稻7號愈傷組織為材料進行遺傳轉化，平均轉化率僅為3.0%。

綜上所述，運用常規農桿菌介導法轉化水稻，粳稻的平均轉化率一般在3%～29%，秈稻的平均轉化率不高于10%。本研究方法獲得了較高的轉化效率，且導入的基因均已在蛋白質水平上表達。而且，本方法不需誘導愈傷組織以及之后的一系列組織培養過程，即不需配制各種培養基、控制各種培養條件并對其不斷進行優化調整。利用傳統農桿菌介導法獲得轉基因植株的周期至少為2～4個月，而應用本方法只需10～15 d。本方法大大縮短培養周期，節省了大量的財力物力，簡化了農桿菌介導轉化法的流程，提高了轉化的工作效率。

對轉基因T1代進行PCR檢測發現，部分轉基因后代群體99%的個體為GUS陽性，而有4個轉基因后代群體發生基因分離，分離比并不符合孟德爾3∶1的分離比。根據前人轉基因遺傳研究的結果，外源基因一般作為1個顯性基因傳遞給后代，遵循孟德爾遺傳分離規律，自交結實后代表現3∶1分離比例，與非轉化親本雜交后代表現 1∶1分離比［21］。

對于后代群體發生分離但又不符合孟德爾式遺傳規律的現象，猜想其原因可能有2個，一是由于轉化針刺生長點的位置不夠精確，使得轉化受體為嵌合體，所以其后代不符合3∶1的分離比。二是TDNA多拷貝地整合到宿主染色體中或部分單株轉入基因丟失等。對于這2種情況，可行的解決辦法是，利用Southern印跡選擇單拷貝植株，繁殖至高世代，直到獲得目標基因純合的株系。

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