江蘇省葫蘆科作物6種病毒的多重RT-PCR方法及應用

任春梅， 程兆榜， 楊 柳， 繆 倩， 周益軍

(江蘇省農業科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

葫蘆科作物是一種僅次于禾本科、豆科和茄科作物的世界性重要經濟作物，主要分布于熱帶和亞熱帶［1-2］。與大田作物相比，該類作物類型多，品種雜，單品種面積小。葫蘆科作物病害中病毒病害的發生最為嚴重，國際病毒分類委員會(ICTV)發布的侵染葫蘆科作物的病毒達38個確定種和9個暫定種［3］。不僅病毒種類繁雜，株系眾多，而且不同病毒同時侵害引起的復合侵染現象普遍，病害發生年度間變化大，給防控和檢測都帶來很大難度［4］。

江蘇省自種植結構調整發展高效農業以來，蔬菜種植業發展迅速，目前復種面積已達1.3×105hm2以上(含西瓜甜瓜)，生產中病毒病是其主要病害問題之一。江蘇省葫蘆科作物病毒病原種類主要有 西 瓜 花 葉 病 毒［5］(Watermelon mosaic virus，WMV)、小西葫蘆黃花葉病毒［6］(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、黃瓜花葉病毒［7］(Cucumber mosaic virus，CMV)和黃瓜綠斑駁病毒［8］(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)，煙草花葉病毒［9］(Tobacco mosaic virus，TMV)和番木瓜環斑病毒［10］(Papaya ringspot virus，PRSV)偶有發生，在田間常發生復合感染現象。針對這一具體情況，開發簡便、快捷、穩定、實用以及能夠同時檢測多個病毒的技術用于生產上病毒病害發生動態的監測，對于葫蘆科作物病毒病防控至關重要。

多重RT-PCR檢測技術最早由Chamberian等［11］于1988年提出，現已廣泛應用于生命科學各個領域，在植物病毒病的檢測中也已成為一種重要的檢測手段［12-16］。與其他檢測方法(生物學、血清學、電鏡觀察、單重 RT-PCR、核酸雜交等［17］)相比，多重RT-PCR檢測技術具有諸多優點，它能在同一個PCR體系中同時擴增多個目的基因，省時，省力，效率高，特別是節省昂貴的實驗試劑和珍貴的實驗材料。由于葫蘆科病毒病的病原多，感染情況復雜，針對單一病毒的檢測方法已遠遠不能滿足檢測工作的需求，所以國內外已有一些此類病毒的多重RTPCR檢測報道。王威麟等［18］針對西瓜上普遍發生的ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV 5種病毒建立了一步RT-PCR檢測方法;趙麗等［19］建立了一種同時檢測葫蘆科作物3種主要病毒ZYMV、WMV和CMV的多重RT-PCR方法;Kwon等［20］用2個多重PCR系統檢測侵染韓國葫蘆科作物的7種病毒。根據前人的研究結果，本試驗針對江蘇省葫蘆科作物病毒病發生的種類和特點，建立一種適用于江蘇省葫蘆科作物病毒病檢測的多重RT-PCR方法，并對江蘇省各地采集的樣品進行檢測應用，以期為江蘇省葫蘆科作物病毒病害的發生動態進行長期有效的監測，從而有針對性地采取防控措施。

1 材料與方法

1.1 毒源和試劑

WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV 和 PRSV 6種病毒的分離物于2012-2014年從江蘇省南京市、鹽城市鹽都區、徐州市、洪澤縣、淮安市等地發病的甜瓜、西葫蘆、西瓜、南瓜等上采集，通過6種病毒的血清學診斷試劑盒(Agdia公司)找到6種病毒單獨侵染的樣品，并在西葫蘆上接種繁殖，樣品保存于-70℃冰箱中。總 RNA提取試劑 Trizol購自Invitrogen公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP、BamHⅠ、SalⅠ購自大連寶生物公司，反轉錄酶M-MLV、RNA酶抑制劑購自Promega公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、大腸桿菌(E.coli DH5ɑ)感受態細胞、pMD18-T載體購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 總RNA提取

在單重RT-PCR中，分別稱取各病毒單獨侵染葉片0.1 g;在多重RT-PCR中，分別稱取等量單獨侵染6種病毒的葉片，WMV、ZYMV、CMV和CGMMV 4種葉片充分混合(標記為H4)，TMV和PRSV 2種葉片充分混合(標記為H2)，H4、H2各取0.1 g。單重和多重RT-PCR中，都以健康西葫蘆葉片為陰性對照(標記為CK)，也取0.1 g。葉片在冰浴條件下迅速徹底研磨，然后用Trizol試劑盒按產品說明書提取總RNA。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank上登錄的各病毒相對保守基因的序列，應用Primer Premier 5.0軟件設計各病毒特異性引物。引物設計完成后，通過NCBI對其特異性進行鑒定，結果表明均具有良好的特異性(表1)。引物由上海英俊生物技術公司合成。

表1 多重RT-PCR擴增6種病毒的特異性引物Table 1 Specific primers for multiple RT-PCR detection of 6 viruses

1.4 單重RT-PCR

以 WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV 和 PRSV單一病毒的RNA為模版，oligodT18引物［21］反轉錄得到 cDNA第一鏈，反應程序參照 M-MLV說明書，15.0 μl 反應體系為:3.0 μl RNA，1.0 μl oligodT18(10 μmol/L)，6.0 μl DEPC-ddH2O，65 ℃變性5 min，迅速置冰上5 min;再加入2.5 μl 5×RT buffer，0.5 μl dNTP( 各 2.5 mmol/L)，0.5 μl RNase Inhibitor(40 U/μl) 和 0.5 μl M-MLV 反轉錄酶(200 U/μl)，短暫離心后DEPC-ddH2O補足至 15.0 μl，42 ℃ 水浴 1 h，70 ℃ 滅活 5 min，置冰上待用。

25.00 μl PCR 標準反應體系:15.75 μl ddH2O，2.50 μl 10 × PCR buffer(Mg2+free)，1.50 μl MgCl2(25 mmol/L)，2.00 μl dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)，1.00 μl上游和下游引物混合物(各 10 μmol/L)，0.25 μl r-Taq DNA 聚合酶(5 U/μl) 和2.00 μl cDNA模板。PCR反應程序:94℃預變性5 min;94℃變性50 s，53℃退火50 s，72℃延伸1 min，循環35次;72℃延伸10 min。取5 μl PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統進行觀察分析。

1.5 多重RT-PCR及體系優化

多重RT-PCR分4重和2重2個反應。4重和2重RT反應體系:加入混合提取的4種和2種病毒的總 RNA(H4 和 H2)各 3.0 μl，同時將 1.0 μl oligodT18的反轉錄引物加入同一反應管中，其他條件與單重RT相同。多重PCR體系在上述25.0 μl單重PCR標準反應體系基礎上，4重PCR的4對引物混合物為4.00 μl［WMV和 CMV上下游引物各0.60 μl，ZYMV 和 CGMMV 上下游引物各 0.40 μl(各10 μmol/L)］，2重 PCR 的2對引物混合物為2.00 μl［TMV 和 PRSV 上下游引物各0.5 μl(各10 μmol/L)］，PCR反應程序參數同上。取5 μl PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

在有效mRT-PCR條件下，考察影響mPCR的主要因素，對某一因素進行考察時，其他因素不變。在試驗過程中對Taq DNA聚合酶濃度分別設0.02 U/μl、0.04 U/μl、0.06 U/μl、0.08 U/μl、0.10 U/μl和0.12 U/μl 6個處理，Mg2+濃度分別設 1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L、4.0 mmol/L、5.0 mmol/L和6.0 mmol/L 6個處理，dNTPs濃度分別設0.10 mmol/L、0.25 mmol/L、0.40 mmol/L、0.55 mmol/L、0.70 mmol/L和 0.85 mmol/L 6 個處理，退火溫度分別設48℃、51℃、53℃、56℃、58℃和60℃，延伸時間分別設50 s、60 s、70 s、80 s、90 s和 100 s，循環次數設20、25、30、35、40 和45，進行多重 RTPCR體系優化。

1.6 多重RT-PCR產物的克隆和測序

多重RT-PCR擴增DNA靶片段采用Axygen柱式膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)回收，回收DNA溶于30 μl的溶解液中。回收產物與pMD18-T載體連接(參照pMD18-T試劑盒說明書)。連接產物轉化大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞，堿裂解法提取質粒，經PCR及酶切鑒定篩選重組質粒。每個分離物挑選2個陽性克隆進行測序，測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.7 多重RT-PCR的靈敏度測定

取混合樣品H4和H2提取的病毒總RNA各5 μl，用BioPhotometer plus核酸蛋白檢測儀測定OD260和OD280，計算各自總RNA濃度。分別以100、10-1、10-2、10-3、10-4和 10-5的倍數進行稀釋，用建立的4重和2重RT-PCR方法進行檢測，觀察結果，分析2種多重RT-PCR方法檢測的靈敏度。

1.8 多重RT-PCR的檢測應用

應用建立的2種多重RT-PCR方法對2014年采自江蘇省13個市縣的210份葫蘆科作物發病樣品進行檢測，并隨機挑選15個樣品用單重RT-PCR方法進行驗證，分析江蘇省葫蘆科作物病毒病的種類及分布狀況。

2 結果與分析

2.1 多重RT-PCR的特異性

用單重、4重和2重RT-PCR法分別從6種病毒單獨侵染、4種病毒混合侵染(H4)、2種病毒混合侵染(H2)的組織中擴增出單一、4條或2條特異性目標條帶，大小約為390 bp、480 bp、670 bp、1 200 bp、330 bp和400 bp，擴增條帶的大小與待檢6種病毒基因預期條帶大小基本一致;陰性對照沒有擴增出任何條帶，且均未出現非特異性條帶(圖1)。結果表明:4重和2重RT-PCR具有較高的特異性，在 4重 RT-PCR中檢測到 CMV、WMV、CGMMV和 ZYMV，在2重 RT-PCR中檢測到TMV和PRSV，且兩步反應中的各條帶大小間有差異，可以明顯地進行區分。

2.2 多重RT-PCR主要影響因素的優化

2.2.1 多重RT-PCR反應體系的優化 為了摸索出既高效又經濟的多重RT-PCR擴增體系，在保證2個反應體系中都有足夠量的r-Taq DNA聚合酶和dNTPs的基礎上，設置 dNTPs、r-Taq DNA聚合酶、Mg2+的濃度梯度。結果(圖2)表明:當dNTPs濃度在0.25～0.85 mmol/L時，4重和2重PCR都能產生較好的條帶;當r-Taq DNA聚合酶濃度為0.10～0.12 U/μl時，4重PCR能擴增出4條帶，2重PCR能擴增出2條帶，濃度越高條帶越亮;當Mg2+濃度達到3.0 mmol/L時，4重和2重PCR都能分別較好地擴增出4條和2條特異性條帶，隨濃度增加條帶變亮，但4重PCR中濃度增加到一定值后反而減弱了mRT-PCR的擴增效果。因此優化后的4重和2重反應體系各參數最終都確定為:dNTPs濃度0.25 mmol/L，r-Taq DNA 聚合酶濃度為 0.10 U/μl，Mg2+濃度3.0 mmol/L。

圖1 多重RT-PCR的特異性Fig.1 Specificity of multiple RT-PCR

2.2.2 多重RT-PCR反應條件的優化 對4重和2重PCR的退火溫度、循環次數和延伸時間都進行了優化。結果(圖3)顯示，4重PCR的退火溫度從53℃到58℃都能獲得理想的條帶，但61℃時擴增效果變弱;循環數在 30～40次時擴增的條帶都較清晰，延伸時間80 s時PCR條帶的亮度最為合適。2重PCR的退火溫度從53℃到61℃時條帶都較為清晰;循環數25～35次時均能獲得特異而清晰的目的條帶;延伸時間從50 s到80 s均能同時出現2條帶，但在60s時條帶最清晰。因此最終確定多重RT-PCR反應的條件為:4重PCR的退火溫度為53℃，循環次數35次，延伸時間80 s;2重PCR的退火溫度為56℃，循環次數30次，延伸時間60 s。

圖2 多重RT-PCR反應體系的優化Fig.2 Optimization for the reaction conditions of mRT-PCR

圖3 多重RT-PCR反應條件參數的優化Fig.3 Optimization for the reaction conditions of mRT-PCR

2.3 多重RT-PCR產物的序列分析

4重和2重RT-PCR擴增產物經割膠回收，分別與pMD 18-T vector進行體外連接，挑取陽性克隆，提取質粒測序。測序結果表明，ZYMV、WMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV的擴增產物序列分別由1 180、485、389、660、410 和325 個核苷酸組成，與設計的PCR產物大小相同，分別為ZYMV-cp基因、WMV-cp基因、CMV-復制酶基因、CGMMV-cp基因、TMV-cp基因和PRSV-cp基因的部分序列。序列同源性分析結果表明，所得序列與GenBank中參考序列的同源性分別達到98.25% 、99.01%、99.93%、98.22%、97.33%和99.32%，證明了2種多重RTPCR檢測結果的可靠性。

2.4 多重RT-PCR的靈敏度

經核酸蛋白檢測儀測定H4和H2的RNA濃度分別為 35.60 μg/μl和 19.33 μg/μl。靈敏度檢測結果(圖4)顯示，4重RT-PCR中RNA稀釋倍數為10-2后有些病毒的條帶微弱或消失，這可能與組織中病毒含量的過低有關，所以能夠同時檢測到4條清晰條帶的最大稀釋倍數為10-2，也即該體系中4重RT-PCR的RNA檢測濃度為0.356 μg/μl;2重RT-PCR中RNA稀釋倍數為10-3時能夠同時檢測到2條清晰的條帶，所以該體系中2重RT-PCR的RNA檢測濃度為19.33 ng/μl。

圖4 2個多重RT-PCR的靈敏度Fig.4 The sensitivities of two mRT-PCR techniques

2.5 多重RT-PCR的檢測應用

應用建立的2種多重RT-PCR方法對采自江蘇省13個市縣210份葫蘆科作物病樣進行檢測。首先隨機選出15個病樣分別進行單重RT-PCR檢測，再進行2種多重RT-PCR檢測(圖5)。將檢測圖譜進行比較，結果顯示各樣品多重RT-PCR檢測結果與單重RT-PCR結果相一致，說明建立的2種多重RT-PCR方法可應用于田間樣品的檢測。田間樣品檢測結果(表2)表明，210份檢測樣品中單獨侵染率僅為24.76%，復合侵染率達75.24%，其中有3個病樣為6種病毒的復合侵染。進一步分析發現江蘇省13個市縣葫蘆科作物病毒的種類以ZYMV和CGMMV為主，主要分布在西瓜、南瓜、葫蘆、甜瓜等作物上，WMV和CMV次之，主要分布在黃瓜、甜瓜、南瓜等作物上，TMV和PRSV只在極少數作物上檢測到，主要在絲瓜、南瓜等上。6種病毒沒有明顯的地域分布傾向，究其原因可能與這幾種病毒的傳播途徑有關。

表2 田間210份葫蘆科作物病樣多重RT-PCR檢測結果Table 2 Detection results of 210 naturally infected samples collected from fields by multiplex RT-PCR

圖5 多重RT-PCR的檢測應用Fig.5 The detection of six viruses in Cucurbit crops by mRT-PCR

3 討論

江蘇省是農業大省，近年來設施農業迅猛發展，據統計近幾年江蘇省葫蘆科作物的種植面積每年穩定在400 000 hm2左右，其中西瓜和甜瓜種植面積約130 000 hm2，已經成為江蘇省農業的支柱產業之一。設施農業的發展，使病毒及其傳毒蚜蟲在棚內順利越冬后，在早春即散布于棚外并大量復制和繁殖，從而導致病害的提前發生和生長季節早期病毒累積量的偏高，形成惡性循環。以上因素加大了病毒病的發生頻率，提高了流行風險，從而加重了病害。根據前期我們對江蘇省設施大棚中葫蘆科作物病毒病的調查，發現4種主要病毒(ZYMV、WMV、CMV、CGMMV)對葫蘆科作物種植業造成的危害日趨嚴重，2種次要病毒(TMV和PRSV)的危害也不容忽視。本研究根據江蘇省葫蘆科作物生產上病毒病的發生情況，建立了能同時檢測這6種病毒的多重RT-PCR方法，在葫蘆科作物的栽培生產中，能夠既快速、準確，又簡便、經濟地檢測出幼苗帶毒情況。對控制病害在田間的發生，減少經濟損失，抗病篩選和病害流行預測具有十分重要的意義。

考慮到6種病毒的特點和數量，將其檢測分成2個RT-PCR反應進行，一個PCR反應中同時檢測4種主要病毒(WMV、ZYMV、CMV、CGMMV)，另一個RT-PCR反應中同時檢測2種次要病毒(TMV和PRSV)。該方法的關鍵因素為特異性引物的選擇，首先使用DNAMAN5.0軟件，對GenBank中收錄的WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV 和 PRSV 病毒各株系、各區域分離物全基因組序列進行比對，確定病毒序列中相對保守區域，在選定的保守區域內使用Oligo5.0軟件設計引物，再通過BLAST分析確保引物的特異性，還利用DNAStar 5.0對這6對引物進行了同源性、二級結構分析，以避免2個多重RTPCR反應引物之間形成復雜的二級結構及引物二聚體而影響擴增效果，最終選擇了G+C含量為45% ～60%、退火溫度相近、擴增片段大小易區分的6對引物。在反轉錄中選擇了OligodT18作為其引物，此引物較為適合植物樣品RNA的反轉錄，能夠較為完整地保留cDNA基礎含量，特異性較高，而且只需一次反轉錄，大大節省了時間和實驗材料。在2個RT-PCR反應中又整合優化了各自體系所需的引物、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs濃度，以及退火溫度、延伸溫度和循環數，對各自PCR體系的靈敏度進行了測定，最終建立了6種病毒多重RT-PCR的方法。用此方法對江蘇的210份葫蘆科作物病樣進行檢測，結果顯示多重RT-PCR和單重RT-PCR檢測結果相當，充分說明了多重RT-PCR方法的實用性。跟蹤監測2014年江蘇省設施大棚中葫蘆科作物的病毒種類，發現主要以種子傳播的CGMMV和ZYMV病毒為主，提示我們此病害的控制應從源頭出發，對種子和幼苗進行早期檢測和處理，也體現了快捷、高效、低成本檢測方法研制的必要性。

本研究根據江蘇省生產上葫蘆科作物易受多種病毒復合侵染的特點，選擇性地對這些病毒進行了2種多重RT-PCR篩選鑒定，較之單一RT-PCR方法具有能節省時間、降低成本、提高效率等優點。以往報道的5重及以上RT-PCR方法［12-16］在實際應用過程中存在干擾因素多、靈敏度低和檢出率低等缺陷，本方法能夠減少污染和反應中的影響因素，提高檢測靈敏度，大大降低漏檢幾率。在葫蘆科作物的生產上，本方法可實現對病毒病的早期診斷，實現實驗室內對病毒病害種類的快速、高效、低成本、大批量檢測，對病害的流行預測預報具有十分重要的意義。

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