一株協助寄主植物緩解鎘脅迫的芽孢桿菌篩選及其耐鎘機制

楊 威， 閆海霞， 汪家璐， 紀麗蓮， 王新風

(1.淮陰師范學院生命科學學院/江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室，江蘇 淮安 223300;2.淮安市農業技術推廣中心，江蘇 淮安 223300)

農用土壤是受人類活動強烈影響的一類特殊土壤，其質量與人類健康密切相關［1］。土壤污染源主要來自工業“三廢”和農藥、化肥，污染物可通過灌溉水進入土壤，也可通過空中的顆粒物(含重金屬和致癌物質等)干濕沉降造成土壤污染，隨著時間的推移，農田表層土壤鎘、鉛、銅、鋅等重金屬含量有增加的趨勢［2］。由于農作物的吸收作用，重金屬元素從土壤遷移轉化到農作物根、莖、葉及果實中去，從而連帶造成農作物的重金屬污染。全球每年釋放到環境中的鎘高達 3.9×104t［3］，而在環洪澤湖地區幾種重金屬污染當中，鎘要高于其他幾種［4］。如何修復受到鎘污染的土地和水體是我們急需面對的問題。

目前，工程修復、電動修復、電熱修復、土壤淋洗以及化學修復等方法雖然在一定程度上能夠緩解重金屬污染，但是卻存在著一些弊端，如實施工程量大、投資費用高，破壞土體結構造成土壤肥力下降，并且還要對換出的污土進行堆放或處理，其中化學修復只是改變重金屬的存在形態，并不能徹底根除重金屬，重金屬還有再度活化污染的可能。另外，一些特定植物也可以通過對金屬離子的吸收、揮發以及穩定對重金屬污染進行修復。這種修復方式雖然效果好、易操作，但是卻只能用于非耕作土壤或水體，對于農田重金屬污染依然無能無力［5］。

利用從自然環境中分離得到的有益微生物來修復農田及水體的重金屬污染就可以克服這一缺點［6］。受到重金屬污染的土壤，往往富集多種耐重金屬的真菌和細菌，其通過多種作用方式影響土壤重金屬的毒性［7-8］。如魏本杰等人報道，產鐵載體細菌可以活化土壤中的鎘［9］。周小梅等人也發現了一株具有較強產酸能力的芽孢桿菌，該菌株除對鎘有耐性之外，對鉛、銅等均具有一定耐受性［10］。除此之外，植物內生菌作為與植物關系緊密的重要微生物資源，也在修復重金屬污染中發揮著作用。如曹喆等人從重金屬鎘(Cd)超累積植物龍葵中分離到一株能夠去除鎘離子的芽孢桿菌［11］。另外，姜敏等人報道從重金屬富集植物(大葉相思)與非富集植物(水禾、水稻)中分離到的重金屬抗性真菌均高于根際真菌［12］，也說明了內生菌在重金屬修復中的巨大潛力。尋找一種能夠有效降低環境中鎘離子濃度從而減少農作物吸收積累的修復方式，對于日益嚴重的耕地重金屬污染來說意義重大。

本研究擬在離體條件下選擇能夠耐受并且降低環境中鎘離子濃度的菌株，并進行盆栽條件下耐隔菌株的活性評價，初步探討其降低鎘離子濃度的可能機制，旨在尋找一條降低農業生產中鎘污染危害的途徑。

1 材料與方法

1.1 離體條件下菌株耐鎘活性檢測

從本實驗室菌株資源庫中選擇了183株細菌，將活化后的菌株接種到含有終濃度為15 mg/L硫酸鎘的LB培養液中，28℃，180 r/min搖床培養24 h，對照組不加硫酸鎘溶液。分別從培養后的培養液中吸取2.0 ml溶液在600 nm下檢測其吸光值，判斷菌株生長情況。另取1.0 ml培養液離心后取上清液，在上清液中分別加入9.0 ml去離子水，轉移至50.0 ml小燒杯中，加入濃硝酸1.0 ml，80℃水浴，蒸發至1.0 ml左右再加入濃硝酸1.0 ml、高氯酸0.5 ml?；靹蚝罄^續水浴蒸發至1.0 ml，冷卻，加入4.0 ml去離子水，混勻后利用原子發射光譜法(ICP)測定其中鎘離子濃度。

1.2 盆栽條件下耐鎘菌株的活性評價

試驗共進行2批次，所用寄主分別為黃瓜品種新津優1號和辣椒品種大禹牛角王，穴盤育苗，待苗長出3～4片真葉后移栽到溫室盆缽中，每盆1株。盆缽高10 cm，口徑12 cm，每盆裝基質400～500 g。溫室條件設定為30℃，光照時間16 h，黑暗時間8 h。

根據菌株離體條件下耐鎘活性篩選結果，選擇培養液中鎘離子濃度下降率最高的5株菌株進行2批次溫室試驗。其中根圍細菌4株，編號分別為H2-1L、H2-22K、H3-11L 和 L5-2L;內生菌1 株，編號為1JN2。每批溫室試驗分別設5個處理組，處理方式如下:移栽時用1×109CFU/ml的菌懸液灌根處理，每盆20 ml，移栽7 d后用30 mg/L硫酸鎘灌根處理，每盆20 ml。另設2個對照，對照1不接種菌株，移栽7 d后用30 mg/L硫酸鎘灌根處理，每盆20 ml;對照2不接種菌株，正常培養。每組重復3次，每個重復24株植株。

1.3 植株生理指標檢測

植株移栽后第21 d分別檢測各處理組根長、鮮質量、葉綠素含量、根系活力以及葉片相對電導勢。檢測方法參照《植物生理學實驗指導》［13］。

每個處理組隨機選取植株3株，準確稱取1 g莖，600℃灰化4 h(干法灰化)，1%鹽酸洗脫灰分，去離子水定容至5 ml，利用原子發射光譜法測定鎘離子濃度。

1.4 耐鎘菌株的鑒定

對菌株進行革蘭氏染色反應，并觀察其形態。采用樹脂型基因組試劑盒(賽百盛有限公司生產)提取菌株基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，利用16S通用引物擴增其16S rDNA片段并送南京金斯瑞有限公司測序，結果提交NCBI數據庫進行比對。結合比對結果和菌株形態對其進行鑒定。

1.5 耐鎘菌株鎘離子耐受機制

選擇溫室試驗中協助寄主植物緩解鎘脅迫效果最好的菌株進行耐鎘機制研究。將濃度為1×107CFU/ml的該菌株菌懸液按照1%接種量接入含有3 g/L硫酸鎘的LB培養液中，28℃、180 r/min搖床培養，分別在12 h、24 h、36 h和48 h吸取培養液，離心收集菌體，超純水洗脫后用2.5%戊二醛固定，通過掃描電鏡觀察菌株的群體以及單細胞形態。以不加鎘離子的處理組作為對照。

2 結果與分析

2.1 離體條件下菌株耐鎘活性檢測

183株細菌中58株在含有15 mg/L Cd2+的LB培養液中培養24 h后OD600大于0.5，說明在外源鎘離子存在的情況下菌株依然能夠正常生長。其中22株菌株培養后溶液中Cd2+濃度下降大于10%，下降最高達51%。選擇其中5株菌株(H2-1L、H2-22K、H3-11L、1JN2、L5-2L)進行盆栽試驗評價其協助寄主植物耐受鎘脅迫的能力。

2.2 耐鎘菌株的溫室評價

與對照1相比(表1)，耐鎘菌株處理組能夠在鎘脅迫下增加黃瓜植株的根長、鮮質量、葉綠素含量以及根系活力，其中菌株1JN2和L5-2L增加效果比較明顯，特別是植株鮮質量、葉綠素含量以及根系活力3項指標。菌株1JN2處理組顯著降低黃瓜植株葉片的相對電導率。

為了更直接反應耐鎘菌株協助寄主植物緩解鎘脅迫能力，我們檢測了鎘脅迫環境下寄主植物對于土壤中鎘離子的吸收和積累情況。如表1所示，在缺少耐鎘菌株保護情況下(對照1)，1 g黃瓜莖組織中鎘離子濃度達到0.1 mg/L，5株耐鎘菌株接種均能在一定程度上減少植物對于基質中鎘離子的吸收，降低幅度從13.53%到23.43%。

表1 耐鎘菌株處理對黃瓜生長指標及體內鎘積累的影響Table 1 Growth and Cd accumulation in cucumber inoculated with Cd-tolerant bacterial strains

與對照1相比，菌株1JN2、L5-2L和 H2-22K處理增加了辣椒植株的根長、鮮質量、葉綠素含量以及根系活力，特別是菌株1JN2處理，辣椒植株的根長、鮮質量、葉綠素含量與正常培養的對照2相當，而對根系活力的增加效果則顯著高于對照2。菌株H3-11L、1JN2和 L5-2L處理與對照1相比均能夠明顯降低寄主植物葉片的相對電導率，表現出在鎘脅迫條件下對于寄主植物的保護作用。相比于黃瓜而言，5株耐鎘菌株降低辣椒植株吸收鎘離子的效果更明顯，降低幅度從29.64%到40.39%(表2)。

綜合2批次溫室盆栽試驗結果，菌株1JN2在鎘脅迫條件下對于寄主植物的綜合保護效應更佳。

2.3 耐鎘菌株鑒定

菌株1JN2呈革蘭氏染色反應陽性，通過形態學與16S rDNA序列比對鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

表2 溫室條件下耐鎘菌株處理對于辣椒生長指標及體內鎘積累的影響Table 2 Growth and Cd accumulation in pepper inoculated with Cd-tolerant bacterial strains

2.4 耐鎘菌株的掃描電鏡觀察

根據掃描電鏡結果，與對照組相比，在培養液中加入鎘離子之后，菌株1JN2的胞外多糖黏度增強，且洗脫后胞外多糖殘留較多。鎘離子處理組在12 h時菌體受到明顯損傷，出現外壁內陷。但是這種現象從24 h開始有一定程度緩解，菌體開始自我復原，至48 h，菌體已經基本恢復到原有狀態(圖1A～1D)。說明此時菌株已適應鎘離子的存在，并且能夠進行正常生長代謝。第48 h時，處理組的胞外多糖開始發生形態上的變化，由最初的絮狀開始固化，形成片層狀固態(圖1E)。

圖1 菌株1JN2在鎘離子處理后群體和單細胞的形態Fig.1 The morphology of population and single cell of Cd-treated strain 1JN2

3 討論

植物內生菌［14］和號稱植物“第二基因組”［15］的植物根圍細菌在寄主植物生長過程中發揮重要作用。這些微生物不僅能夠協助寄主植物阻止病原菌的入侵［16］，為植物生長提供必要的營養［17］，還能協助寄主抗逆，包括抗旱、耐鹽堿以及耐重金屬污染等［18-21］。

與以往的報道中發現內生菌在重金屬抗性方面的優勢［12，22］類似，本研究篩選出的一株植物內生菌1JN2，在離體條件和溫室盆栽試驗中均表現出顯著耐鎘活性，并降低植物體內鎘離子的吸收累積，且活性顯著高于植物根圍細菌。該菌株能夠逐漸適應鎘脅迫壓力，在處理24 h后開始進行菌體的自我復原。從胞外多糖的形態來看，推測該菌株可能利用胞外多糖固定環境中的鎘離子，從而減少寄主植物對于鎘離子的吸收。在前期的研究中我們還發現菌株1JN2同時具有產IAA以及多種胞外酶的活性，能夠協助寄主植物防控土傳病害的侵染［23］。在農業生產環境不斷惡化的大背景下，該菌株表現出一定的開發潛力。在今后的研究中，我們將重點研究其耐鎘機制、發酵條件優化以及劑型開發等，為農業安全生產提供保障。

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