生長素對豬孤雌激活胚胎體外發育的影響及其受體基因的表達模式

李運生， 童彬彬， 劉曉蕊， 凌英會， 方富貴， 張運海， 劉 亞

(1.安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036;2.安徽地方畜禽遺傳資源保護與生物育種省級實驗室，安徽 合肥 230036)

生長素(Ghrelin)是一種生長激素促分泌素受體的天然配基，廣泛表達于動物胃、消化道、肺、心臟、乳腺等多個器官［1］，調控食物攝取和促進生長激素分泌［2］。生長素在生殖器官如子宮內膜、胎盤、睪丸、卵巢和胚胎中均有表達［3-4］，暗示其在生殖軸中起調控作用［5］。胚胎發育是生殖發生的重要過程，也是生殖研究的重點內容。關于生長素對哺乳動物附植前胚胎發育的作用研究較少，且結果也不一致。在小鼠［6-7］和牛［8］胚胎發育過程中添加生長素可抑制囊胚的發育效率。但在水牛［9］、綿羊［10］和豬［11］上，卻發現生長素可以促進胚胎的體外發育能力。鑒于生長素在不同物種間的差異表現，有必要對其在胚胎發育過程中的作用機制進行探討。

生長素主要通過與其特異性受體GHSR-1a結合發揮生物學效應。Kawamura［5］發現附植前胚胎發育過程中生長素受體基因GHSR-1a mRNA僅在小鼠致密化、囊胚及孵化胚階段轉錄。而Du等［12］認為綿羊早期胚胎各發育時期均有GHSR-1a表達。目前在豬的胚胎上，GHSR-1a的存在情況及其表達模式未有研究，生長素在物種間的差異作用是否與其受體的表達模式相關亦未有報道。

本試驗擬在豬孤雌胚培養基中添加不同濃度的生長素，研究其在豬孤雌胚早期發育中的作用及對發育速度的影響，并檢測豬孤雌激活胚胎不同發育時期GHSR-1a的轉錄及其表達水平，以期探明生長素及其受體GHSR-1a對哺乳動物附植前胚胎發育的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬卵巢采自安徽合肥肥東福潤屠宰場，置入38℃含青霉素及鏈霉素的生理鹽水保溫瓶中保存。

1.2 豬卵母細胞的獲得及體外成熟

參照Li［13］的方法，生理鹽水清洗卵巢后用18號針頭抽取2～6 mm卵泡，體式顯微鏡下挑選卵丘包裹完整，2層以上顆粒細胞層的卵丘卵母細胞復合體(Cumulus-oocyte complex，COCs)，按照每50枚左右一孔的密度將COCs移入放有400 μl成熟培養液的四孔板，38.5℃、5%CO2、100%濕度的環境中體外成熟42～44 h。

1.3 豬孤雌胚的獲得

用0.1%透明質酸酶脫除卵丘細胞，顯微鏡下選擇透明帶完整、卵周隙清晰、已排出第一極體的卵母細胞，并在預熱的 f2中洗滌3遍［13］。放入融合槽中用 1.56 kV/cm、80 μs、1 次直流電脈沖進行電激活。移出后用胚胎培養液(Porcine zogyte medium 3，PZM3)［14］將 卵 母 細 胞 洗 滌 3遍，轉移到覆蓋石蠟油的化學輔助激活液(PCC，PZM3+10 μg/ml松胞素 B+10 μg/ml環已酰亞胺)中作用4 h，最后移入PZM3胚胎培養液中培養。培養條件為38.5℃、5%CO2、飽和濕度。

1.4 間接免疫熒光染色

參考周娜汝［15］的方法，一抗孵育時在DPBS+1%BSA中加入 GHSR-1a抗體(ABcam公司生產，ab95250)(1∶200稀釋)，對照組用PBS代替。胚胎轉移到玻片中壓片并封片，置于激光共聚焦顯微鏡(Olympus，FV1000)下掃描拍攝。每組采用相同的曝光值采集圖像并用Image J軟件分析計算熒光強度。

1.5 胚胎細胞總RNA的提取及反轉錄

胚胎RNA提取選用Qiagen公司試劑盒RNeasy Micro Kit，No.74004，總RNA反轉錄采用Qiagen公司試劑盒QuantiTect Reverse Transcription Kit，No.205311。

1.6 引物設計與合成及熒光定量PCR

GenBank中查找GHSR序列(NM_032075.3)，設計引物為正向:5'-AACGACTCGCTAGTGGAGGA-3'，反 向:5'-GAAGCGTGACACTACCAGCA-3'。引物均由生工生物工程有限公司合成。以GAPDH為內參基因，用實時熒光定量PCR檢測GHSR-1a的相對表達量。采用2-△△CT(Livak)法分析GHSR-1a的表達水平。

1.7 不同濃度生長素對豬孤雌胚早期發育的影響

在豬的孤雌激活體外培養液中添加不同濃度生長素［0 mg/L(對照)、0.1 mg/L、1.0 mg/L、10.0 mg/L、100.0 mg/L］，分別于培養 30～32 h、44～48 h、80 ～82 h、104 ～108 h、146 ～148 h 時統計其 2-細胞胚胎數、4-細胞胚胎數、8-細胞胚胎數、致密桑葚胚數及囊胚發育數，計算其卵裂率、囊胚率、桑葚胚率。試驗重復5次。另外，在豬的孤雌激活體外培養液中添加不同濃度生長素［0 mg/L(對照)、0.1 mg/L、1.0 mg/L、10.0 mg/L、100.0 mg/L］，分別于培養 24 h、40 h、72 h、102 h、132 h 時統計其 2-細胞胚胎數、4-細胞胚胎數、8-細胞胚胎數、桑葚胚數及囊胚發育數，計算其卵裂率、囊胚率，比較不同組間發育速度。試驗重復5次。

1.8 豬附植前胚胎中GHSR-1a mRNA和GHSR-1a蛋白檢測

分別在2-細胞期、4-細胞期、8-細胞期、桑葚胚期、囊胚期收集胚胎［15］，采用熒光定量PCR技術檢測豬孤雌激活胚GHSR-1a mRNA在上述各階段的表達水平，試驗重復3次。收集2-細胞期、4-細胞期、8-細胞期、桑葚胚期與囊胚期的豬孤雌發育胚胎(每組20枚)，采用間接熒光免疫法檢測不同發育階段胚胎中GHSR-1a蛋白水平。

1.9 統計分析

應用SPSS 11.5軟件系統進行數據處理與統計分析。

2 結果與分析

2.1 生長素濃度對豬孤雌胚胎早期發育的影響

如表1所示，添加10.0 mg/L生長素組的豬孤雌胚胎4-細胞發育率、8-細胞發育率和桑葚胚率均顯著高于對照組和0.1 mg/L組(P＜0.05);添加100.0 mg/L生長素組的豬孤雌胚胎4-細胞發育率、8-細胞發育率均顯著高于添加0.1 mg/L組(P＜0.05)。添加0.1 mg/L和1.0 mg/L生長素組在各時期胚胎發育效率均與對照組無顯著差異(P＞0.05)。

如圖1所示，胚胎發育24 h后，添加生長素的試驗組豬孤雌胚2-細胞胚胎的發育速率與對照組無顯著差異(P＞0.05);胚胎發育40 h、72 h、102 h時，添加10.0 mg/L生長素組豬孤雌胚的4-細胞胚胎、8-細胞胚胎及桑葚胚發育速率明顯快于對照組(P＜0.05)，其他組與對照組無顯著差異(P＞0.05);胚胎發育132 h后，添加生長素的試驗組豬孤雌胚囊胚的發育速率與對照組無顯著差異(P＞0.05)。

表1 不同濃度生長素對豬孤雌胚胎早期發育能力的影響Table 1 Effects of different concentrations of ghrelin on the in vitro developmental competence of porcine parthenogenetic embryos

2.2 豬孤雌胚各發育時期GHSR-1a的表達

熒光定量 PCR結果(圖2)顯示，GHSR-1a mRNA在豬孤雌胚早期發育的各個階段均有表達，其中在2-細胞期、4-細胞期、8-細胞期及桑葚胚期表達量無顯著差異，囊胚期表達量顯著下降(P＜0.05)。

2.3 在豬孤雌胚早期發育過程中GHSR1a蛋白的表達量

從圖3和圖4可以看出，GHSR-1a蛋白在豬孤雌胚早期發育的各個時期均能檢測到，囊胚期的表達量顯著低于4-細胞期、8-細胞期和桑葚胚期(P＜0.05)。

圖1 添加生長素后豬孤雌胚早期發育速率的變化Fig.1 The dose-dependent effects of ghrelin on the early development rate of porcine parthenogenetic embryos

圖2 豬孤雌胚胎早期發育各時期GHSR-1a mRNA的相對表達量Fig.2 Relative mRNA expression of GHSR-1a at various developmental stages ofporcineparthenogenetic embryos

3 討論

近年來，生長素對生殖器官的作用不斷被證實，但其在胚胎發育過程中的功能還存在爭議。2003年，日本研究人員發現當向小鼠胚胎體外培養液中添加100 nm/L生長素時可抑制小鼠胚胎發育［5］。習海濤［7］發現在體外培養基中添加 0.1 mg/L的生長素顯著降低了小鼠自然受精胚和孤雌胚的桑葚胚及囊胚發育率，但進一步提高生長素的添加濃度后，桑葚胚率和囊胚率又有一定程度的回升;而對于體外受精胚，添加1.0 mg/L生長素顯著降低了其囊胚發育率，提高生長素的濃度后，囊胚率并沒有明顯的回升趨勢。另有研究報道在培養基中添加50.0 mg/L的生長素顯著提高了水牛孤雌胚的囊胚發育率［9］。本研究結果顯示，胚胎培養過程中添加10.0 mg/L生長素可以顯著提高豬孤雌胚的4-細胞發育率、8-細胞發育率、桑葚胚率及囊胚發育率(P＜0.05)，但100.0 mg/L的添加濃度降低了豬孤雌胚的囊胚發育率，這與Zhang等人［11］研究結果一致。推測生長素對哺乳動物早期胚胎發育會產生一定促進作用，但在不同物種和不同來源的胚胎及生長素的添加濃度上表現不一。

圖3 GHSR1a蛋白在豬孤雌胚早期發育中的表達Fig.3 GHSR1a expression at various developmental stages of porcine parthenogenetic embryos

圖4 豬孤雌胚胎早期發育各時期GHSR-1a的表達量Fig.4 GHSR-1a levels at various developmental stages of porcine parthenogenetic embryos

向牛體外成熟的卵母細胞中添加800 pg/ml的生長素后發現，成熟18 h后MII期卵母細胞數顯著高于對照組，但成熟24 h時卵母細胞數與對照無顯著差異，成熟后體外受精時，成熟18 h的卵母細胞形成的囊胚率顯著高于成熟24 h組［8］。提示我們生長素可能在卵母細胞發育或胚胎發育過程中起作用。本研究結果表明，添加10.0 mg/L生長素組豬孤雌胚胎4-細胞胚胎、8-細胞胚胎及桑葚胚發育速率明顯快于對照組(P＜0.05)，但2-細胞胚和囊胚在發育速度上與對照組無顯著差異(P＞0.05)。說明生長素有可能會促進胚胎的早期發育速度。從4-細胞期到桑葚胚期間其特異性受體GHSR-1a表現出的mRNA高表達模式與胚胎發育速度相一致，推測生長素通過GHSR-1a作用于胚胎發育。但生長素通過何種機制促進了胚胎發育的速度，還需要進一步研究。

2008年，Du等［12］檢測了綿羊卵母細胞和不同發育時期的胚胎生長素及其受體基因GHSR-1a mRNA轉錄水平，發現在附植前胚胎不同發育階段均有表達，其中GHSR-1a mRNA轉錄水平從GV期到MII期依次遞減，在2-細胞期升高，至囊胚期保持穩定。Kawamura等［5］研究結果表明小鼠體外受精胚自桑葚胚以后的附植前胚胎均檢測到生長素及其受體GHSR-1a的表達，表達從桑葚胚到囊胚呈增加趨勢，而此前各時期則沒有生長素 及GHSR-1a的表達。在本研究中，GHSR-1a mRNA在豬孤雌胚胎早期發育的各個時期均可被檢測到，在2-細胞期轉錄水平較高，在4-細胞期降低，8-細胞期回升，至囊胚期迅速下降。這可能是由于在2-細胞期之前，豬胚內還存在大量母源mRNA，而在4～8-細胞期發生胚胎基因組激活，原來的母源mRNA大部分降解，導致4-細胞期GHSR-1a mRNA降低，而8-細胞期時，胚胎基因組已激活轉錄，因此GHSR-1a mRNA回升。GHSR-1a在這段時間的變化起何種作用，還需要進一步研究。在本研究中發現GHSR-1a mRNA與蛋白在不同發育時期相對豐度的變化趨勢并不完全一致，這可能是由于從mRNA到蛋白還受諸如mRNA穩定性、翻譯效率、蛋白壽命等多種因素影響所致。

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