Eaf2基因調控microRNA抑制白內障發生的機制研究

秦宇，趙江月，羅文婷2，李晶，吳欣蔚，劉佳，閻啟昌，張勁松

（1.中國醫科大學附屬第四醫院眼科，中國醫科大學眼科醫院，遼寧省晶狀體學重點實驗室，沈陽 110005；2.中國醫科大學附屬盛京醫院實驗研究中心，沈陽 110004）

Eaf2基因調控microRNA抑制白內障發生的機制研究

秦宇1，趙江月1，羅文婷2，李晶1，吳欣蔚1，劉佳1，閻啟昌1，張勁松1

（1.中國醫科大學附屬第四醫院眼科，中國醫科大學眼科醫院，遼寧省晶狀體學重點實驗室，沈陽 110005；2.中國醫科大學附屬盛京醫院實驗研究中心，沈陽 110004）

目的探討Eaf2基因敲除小鼠中microRNA的表達情況，以及Eaf2基因對人晶狀體上皮細胞凋亡及晶狀體內microRNA表達的影響。方法利用Lipofectamine 2000瞬時轉染pEGFP-C1-Eaf2質粒過表達Eaf2基因，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化，利用Real time q-PCR方法檢測人晶狀體上皮細胞中microRNA的表達情況；利用Real time q-PCR方法檢測Eaf2基因敲除小鼠microRNA的表達情況。結果pEGFP-C1-Eaf2質粒轉染組細胞凋亡率顯著低于對照組，miR-125b、let-7a的表達顯著高于對照組，而miR-204的表達顯著低于對照組；Eaf2基因敲除小鼠miR-125b、let-7a的表達顯著低于對照組，而miR-204的表達顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。結論Eaf2基因可能通過調控microRNA的表達抑制人晶狀體上皮細胞凋亡，從而在白內障發生中發揮晶狀體保護作用。

Eaf2；microRNA；基因調控；白內障

11-19賴氨酸富集白血病（eleven-nineteen lysine -rich leukemia，ELL）基因相關因子2（ELL-associated factor 2，Eaf2）是一種富含賴氨酸的RNA聚合酶Ⅱ的延伸因子，位于3號染色體長臂3q13.33，編碼由260個氨基酸組成的蛋白，可以通過與ELL家族蛋白作用正性調控RNA聚合酶Ⅱ的轉錄延長。近年來，有關Eaf2基因功能的研究多集中在其抑癌作用的分子機制領域［1］。迄今為止，國內外學者對Eaf2基因在眼部的功能了解甚少。研究發現，Eaf2基因參與紫外線照射引起的DNA損傷修復活動［2］，而紫外線是年齡相關性白內障發生的最重要的危險因素［3］，提示Eaf2蛋白可能作為保護因子參與晶狀體細胞的代謝和損傷修復，從而防止或延緩白內障的發生。而晶狀體上皮細胞凋亡是除先天性白內障以外其他類型白內障發生的共同細胞學基礎［4］，推測Eaf2可能參與調控晶狀體上皮細胞凋亡的過程。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是近年發現的一種小分子非編碼RNA，它可以通過調節RNA半衰期或者與3′UTR區結合抑制靶基因翻譯，從而在轉錄后水平影響發育、增殖、分化、凋亡等過程中組織特異性基因的表達［5～7］。microRNA作為轉錄因子重要的靶分子在細胞功能調控中發揮核心作用。已有研究證實，microRNA與細胞凋亡密切相關［8～10］。因此，推測Eaf2基因可能通過調控microRNA的表達影響晶狀體細胞凋亡等生物學過程，最終作為保護因子，干預或延緩白內障的發生。

前期研究證實，miR-125b通過直接抑制靶基因p53的表達調控人晶狀體上皮細胞凋亡［11］。利用生物信息學預測軟件TargetScan 5.2，Diana-micro T和miRanda共同預測得出，miR-204可能靶向調控B淋巴細胞瘤/白血病2（bcl-2）基因，let-7a可能靶向調控天冬氨酸特異性的半胱氨酸酶3（caspase-3）基因，而bcl-2基因和caspase-3基因在線粒體通路這一最主要的凋亡通路中發揮重要作用，提示miR-204、let-7a可能與凋亡密切相關。因此，本研究選擇了miR-125b、miR-204和let-7a這3種microRNA作為研究對象。

本研究利用Eaf2基因敲除小鼠及pEGFP-C1-Eaf2質粒，通過轉染、流式細胞技術、Real time q-PCR等方法，進行了離體及在體實驗，探討Eaf2基因敲除小鼠中microRNA的表達情況，以及Eaf2基因對人晶狀體上皮細胞凋亡的影響及晶狀體內microRNA的調控作用，進一步探討Eaf2基因在白內障發生中是否具有晶狀體保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人晶狀體上皮細胞系（SRA01/04）由美國Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠贈。

1.1.2 實驗動物：Eaf2基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠由美國Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠贈。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染：SRA01/04細胞利用DMEM培養基（含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。將SRA01/04細胞于轉染前24 h接種于6孔細胞培養板中，使轉染時細胞密度達到30%～50%。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國）將pEGFP-C1-Eaf2質粒和pEGFP-C1質粒分別轉染至SRA01/04細胞中，轉染后48 h進行相關檢測。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率：利用細胞凋亡PI染色試劑盒（KenGEN公司，中國），用1×Buffer A洗滌細胞1次（離心2 000 r/min，5 min），收集并調整細胞濃度為1×106/mL；細胞加9倍體積的70%乙醇，于-20℃固定至少12 h；離心收集細胞后，用1×Buffer A洗細胞除去乙醇，細胞重懸于500 μL Buffer A中；加入RNase A，使其終濃度為0.25 mg/mL，37℃反應30 min；加入5 μL PI，室溫避光染色30 min；流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.3 實驗動物標本制備：將Eaf2基因敲除小鼠（Eaf2-/-）和C57BL/6小鼠交配，子代小鼠留取鼠尾提取DNA，PCR鑒定基因型。選取Eaf2雜合子小鼠（Eaf2+/-）相互交配，子代小鼠留取鼠尾提取DNA，PCR鑒定基因型。選取基因型為Eaf2-/-的小鼠作為實驗組，同窩基因型為Eaf2+/+的小鼠作為對照組。乙醚麻醉小鼠，斷頸處死，顯微鏡下解剖，取眼球晶狀體，DEPC-PBS沖洗1～2次，備后續實驗使用。

1.2.4 Real time q-PCR檢測microRNA的表達：利用Trizol?Reagent（Invitrogen公司，美國）提取總RNA，PrimerScriptTMRT Enzyme Mix（Takara公司，日本）逆轉錄為cDNA。利用SYBR Premix Ex TaqⅡ（Takara公司，日本）檢測microRNA的表達量，RNU6B為內參對照。miR-125b、miR-204和let-7a的RT引物、特異性上游引物和通用下游引物由Ribobio公司合成。利用ABI 7500（Applied Biosystems公司，美國）進行反應，反應體系為20 μL，反應條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個循環；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。經過3次獨立實驗后得到的數據，利用公式RQ=2-ΔΔCt進行分析。

1.3 統計學分析

應用SPSS 16.0統計學軟件，采用獨立樣本t檢驗進行分析，數據以x±s表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Eaf2基因抑制人晶狀體上皮細胞凋亡

向SRA01/04細胞中分別轉染pEGFP-C1-Eaf2質粒和pEGFP-C1質粒，轉染后48 h，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化。結果顯示：pEGFP-C1-Eaf2質粒轉染組細胞凋亡率顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。提示Eaf2基因可能抑制人晶狀體上皮細胞凋亡。

圖1 Eaf2基因對人晶狀體上皮細胞凋亡的調控Fig.1 The effect of Eaf2on apoptosis of human lens epithelial cells

2.2 Eaf2基因調控晶狀體內microRNA的表達

向SRA01/04細胞中分別轉染pEGFP-C1-Eaf2質粒和pEGFP-C1質粒，轉染后48 h，利用Real time q-PCR方法檢測microRNA的表達情況，RNU6B作為內參對照。結果顯示：pEGFP-C1-Eaf2質粒轉染組miR-125b、let-7a的表達顯著高于對照組（P＜0.01），而miR-204的表達顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 Eaf2基因對晶狀體內microRNA表達的調控Fig.2 The effect of Eaf2on the expression of microRNA in lens

2.3 Eaf2基因敲除小鼠microRNA的表達

利用Real time q-PCR方法，檢測基因型為Eaf2-/-的小鼠和同窩基因型為Eaf2+/+的小鼠microRNA的表達情況，RNU6B作為內參對照。結果顯示：Eaf2-/-組miR-125b、let-7a的表達顯著低于對照組（P＜0.01），而miR-204的表達顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3。

3 討論

圖3 Eaf2基因敲除小鼠microRNA的表達Fig.3 The expression of microRNA in Eaf2 knockout mice

Eaf2基因最早因其調控胚胎發育及在前列腺中對雄激素的應答而被發現。有關Eaf2基因功能的研究，國內外學者多集中在其抑癌作用的分子機制領域，例如，在前列腺癌發病分子機制領域及對胚胎發育的影響等方面［1］。Eaf2作為ELL因子的結合蛋白發揮抑癌作用，同時ELL與p53也可以結合。Su等［12］在肝癌和前列腺癌組織中發現Eaf2與p53結合后可以調控血小板凝血酶致敏蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）啟動子的活性，從而抑制腫瘤血管的生成，證實了Eaf2與p53之間的伴侶和調控關系。而p53具有誘導microRNA轉錄、促進特異的microRNA成熟，通過調控microRNA影響細胞增殖、分化等的功能［13］。p53在晶狀體內大量表達，且表達位置與Eaf2一致［14］。提示Eaf2可能參與對細胞凋亡的調控。

然而，目前有關Eaf2基因在眼部的功能方面的研究較少。研究證實，Eaf2基因在發育中的晶狀體赤道部上皮細胞、分化的晶狀體纖維細胞及神經視網膜中大量表達，對眼球發育起重要的調節作用［15］。另有研究發現，Eaf2基因參與紫外線照射引起的DNA損傷修復活動［2］，而紫外線是年齡相關性白內障發生的最重要的危險因素［3］，紫外線照射后可以損傷晶狀體上皮細胞間縫隙連接蛋白（Cx），影響細胞間信息傳遞，是白內障發生的機制之一［16］，人類或者動物受到紫外線急性輻射損傷或低劑量照射累積均可以導致白內障［17］。因而我們推測Eaf2基因在白內障的發生中可能發揮一定的作用。

microRNA是長約21～25個核苷酸的一類單鏈內源性小分子非編碼RNA［18］，在不同組織中表達具有特異性，在轉錄后水平對靶基因進行負向調控。單個microRNA可以作用于多個靶基因，而多個microRNA可以作用于同一靶基因，由此形成了microRNA復雜的調控網絡。人類整個基因組中，約1/3的編碼蛋白基因受其調控［19］。microRNA的出現改變了以往對非編碼RNA的認知。microRNA參與生命過程中包括發育、細胞增殖、凋亡等一系列重要的活動［8～11］，它與疾病的關系日益引起人們關注。研究證實，microRNA與多種疾病，包括眼部疾病的發生和發展有密切的聯系［20～22］。隨著新的生物信息學方法和技術的產生，microRNA成為基因診斷和治療的新熱點。

本研究結果發現：向SRA01/04細胞中轉染pEGFP-C1-Eaf2質粒，使Eaf2基因過表達，細胞凋亡率顯著降低，提示Eaf2基因可能抑制人晶狀體上皮細胞凋亡。Eaf2基因過表達使miR-125b、let-7a的表達顯著升高，miR-204的表達顯著降低。而體內實驗中，Eaf2基因敲除小鼠miR-125b、let-7a的表達顯著降低，miR-204的表達顯著升高。

綜上所述，強烈提示Eaf2這種轉錄因子可能通過調控microRNA的表達影響晶狀體細胞凋亡，作為保護因子干預或防止白內障的發生。Eaf2基因很有可能是影響白內障發生的關鍵基因，明確其在晶狀體內的調控功能可能會從分子水平揭示白內障發病的關鍵環節，值得進一步深入研究。

［1］Pascal LE，Ai J，Rigatti LH，et al.EAF2 loss enhances angiogenic effects of Von Hippel-Lindau heterozygosity on the murine liver and prostate［J］.Angiogenesis，2011，14（3）：331-343.

［2］Zhuang F，Yen P，Zhao J，et al.Dynamic intracellular distribution of Eaf2 and its potential involvement in UV-Induced DNA damage response［J］.DNA Cell Biol，2008，27（12）：649-656.

［3］Coroneo M.Ultraviolet radiation and the anterior eye［J］.Eye Contact Lens，2011，37（4）：214-224.

［4］Li WC，Kuszak JR，Dunn K，et al.Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals［J］.J Cell Biol，1995，130（1）：169-181.

［5］Chen K，Rajewsky N.The evolution of gene regulation by transcription factors and microRNAs［J］.Nat Rev Genet，2007，8（2）：93-103.

［6］Peters L，Meister G.Argonaute proteins：mediators of RNA silencing［J］.Mol Cell，2007，26（5）：611-623.

［7］Pillai RS，Bhattacharyya SN，Filipowicz W.Repression of protein synthesis by miRNAs：how many mechanisms?［J］.Trends Cell Biol，2007，17（3）：118-126.

［8］Zhou S，Zhang S，Wang Y，et al.miR-21 and miR-222 inhibit apoptosis of adult dorsal root ganglion neurons by repressing TIMP3 following sciatic nerve injury［J］.Neurosci Lett，2015，586：43-49.

［9］Shang C，Hong Y，Guo Y，et al.MiR-210 Up-regulation inhibits proliferation and induces apoptosis in glioma cells by targeting SIN3A［J］.Med Sci Monit，2014，20：2571-2577.

［10］Zhang R，Chen X，Zhang S，et al.Upregulation of miR-494 inhibits cell growth and invasion and induces cell apoptosis by targeting cleft lip and palate transmembrane 1-Like in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Dig Dis Sci，2014，Dec 6.［Epub ahead of print］.

［11］Qin Y，Zhao J，Min X，et al.MicroRNA-125b inhibits lens epithelial cell apoptosis by targeting p53 in age-related cataract［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1842（12PA）：2439-2447.

［12］Su F，Pascal LE，Xiao W，et al.Tumor suppressor U19/EAF2 regulates thrombospondin-1 expression via p53［J］.Oncogene，2010，29（3）：421-431.

［13］Feng Z，Zhang C，Wu R，et al.Tumor suppressor p53 meets microRNAs［J］.J Mol Cell Biol，2011，3（1）：44-50.

［14］Wiley LA，Rajagopal R，Dattilo LK，et al.The tumor suppressor gene Trp53 protects the mouse lens against posterior subcapsular cataracts and the BMP receptor Acvr1 acts as a tumor suppressor in the lens［J］.Dis Model Mech，2011，4（4）：484-495.

［15］Li M，Wu X，Zhuang F，et al.Expression of murine ELL-associated factor 2（Eaf2）is developmentally regulated［J］.Dev Dyn，2003，228（2）：273-280.

［16］Wu D，Zhao J，Zhang J.Ultraviolet A exposure induces reversible disruption of gap junction intercellular communication in lens epithelial cells［J］.Int J Mol Med，2011，28（2）：239-245.

［17］Roberts JE.Ultraviolet radiation as a risk factor for cataract and macular degeneration［J］.Eye Contact Lens，2011，37（4）：246-249.

［18］Griffiths-Jones S.The microRNA registry［J］.Nucleic Acids Res，2004，32：D109-D111.

［19］Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets［J］.Cell，2005，120（1）：15-20.

［20］Li Y，Piatigorsky J.Targeted deletion of Dicer disrupts lens morphogenesis，corneal epithelium stratification，and whole eye development［J］.Dev Dyn，2009，238（9）：2388-2400.

［21］Zhao JJ，Yang J，Lin J，et al.Identification of miRNAs associated with tumorigenesis of retinoblastoma by miRNA microarray analysis［J］.Childs Nerv Syst，2009，25（1）：13-20.

［22］Shen J，Yang X，Xie B，et al.MicroRNAs regulate ocular neovascularization［J］.Mol Ther，2008，16（7）：1208-1216.

（編輯王又冬）

Mechanism of Eaf2Gene Regulating microRNA in Inhibiting the GenesisofCataract

QINYu1，ZHAOJiang-yue1，LUOWen-ting2，LIJing1，WUXin-wei1，LIUJia1，YANQi-chang1，ZHANGJin-song1
（1.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Eye Hospital of China Medical University，Key Lens Research Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110005，China；2.Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the expression ofmicroRNAin Eaf2knockoutmice and the effectof Eaf2on the apoptosis ofhuman lens epithelial cells and the expression of microRNA in lens.MethodspEGFP-C1-Eaf2 was transfected into SRA01/04 cells using Lipofectamine 2000 to over express Eaf2gene，and then the flow cytometry was used to detect cell apoptosis rate.And real time q-PCR was used to measure the expression of microRNA both in human lens epithelial cells and Eaf2 knockout mice.ResultsCompared with controls，the apoptosis rate of cells transfected with pEGFP-C1-Eaf2 was reduced，the expression ofmiR-125b and let-7a wassignificantly increased and miR-204 wasdecreased in cells transfected with pEGFP-C1-Eaf2.Compared with controls，the expression of miR-125b and let-7a was lower and miR-204 was higher in Eaf2knockout mice.Each result was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionEaf2might inhibit apoptosis of human lens epithelial cells via regulating the expression ofmicroRNA.Eaf2 may have a protective effectforthe lensin the genesisofcataract.

Eaf2；microRNA；gene regulation；cataract

R776.1

A

0258-4646（2015）03-0199-04

國家自然科學基金（81270988）；遼寧省教育廳科學技術研究一般項目（L2014305）；中國醫科大學附屬第四醫院青年創新發展基金項目（YB1217）

秦宇（1982-），女，講師，博士.

張勁松，E-mail：zhangjs0331@126.com

2014-12-23

網絡出版時間：